Quy trình kiểm nghiệm Escherichia coli

ISO 16649 – 3: 2015: Phát hiện E.coli dương tính β-D-glucuronidase /Detection of β-D-glucuronidase positive E.coli

ISO 7251: 2005/Amd 1: 2023: Phát hiện E.coli giả định /Detection of presumptive E.coli

ISO/TS 13136: 2012: Phát hiện E.coli sinh độc tố Shiga (STEC) và xác định các serotype O157, O111, O26, O103 và O145 /Detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups

ISO 9308 – 1: 2014/Amd 1: 2016: Định lượng E.coli Phương pháp lọc qua màng /Enumeration of E.coli Membrane filtration method

NMKL 96: 2009: Định lượng E.coli Kỹ thuật MPN /Enumeration of E.coli MPN technique

SMEWW 9221 (B) (E) (G): 2023: Định lượng E.coli Kỹ thuật MPN /Enumeration of E.coli MPN technique

NMKL 125: 2005: Định lượng E.coli Kỹ thuật đếm khuẩn lạc /Enumeration of E.coli Colony count technique

ISO 16649 – 2: 2001: Định lượng E.coli dương tính β-D-glucuronidase Kỹ thuật đếm khuẩn lạc /Enumeration of β-D-glucuronidase positive E.coli Colony count technique

• Môi trường VRBA (Violet Red Bile Agar) hoặc VRB-MUG
• Môi trường EMB (Eosin Methylene Blue Agar)
• Môi trường TBX (Tryptone Bile X-Glucuronide Agar)
• Môi trường sử dụng: Buffered Peptone Water (BPW)
• Lauryl Sulfate Tryptose Broth (LSTB).

Quy trình kiểm nghiệm Escherichia coli (E. coli) trong thực phẩm thường tuân theo các tiêu chuẩn như ISO 16649-2:2001, TCVN 7924-2:2008, hoặc các phương pháp vi sinh tiêu chuẩn khác. Dưới đây là quy trình cơ bản:

1. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

• Thu thập mẫu thực phẩm (thịt, sữa, hải sản, rau củ, nước…) theo quy trình lấy mẫu chuẩn.
• Cân 25g mẫu thực phẩm, đồng nhất trong 225ml môi trường đệm Peptone Water (BPW).
• Lắc đều và để yên trước khi thực hiện bước tiếp theo.

2. Tiền môi trường tăng sinh (Pre-enrichment)

• Môi trường sử dụng: Buffered Peptone Water (BPW) hoặc Lauryl Sulfate Tryptose Broth (LSTB).
• Ủ ở 37°C trong 18-24 giờ.
• Mục đích: Giúp hồi phục tế bào E. coli nếu có trong mẫu.

3. Cấy phân lập trên môi trường chọn lọc

• Môi trường VRBA (Violet Red Bile Agar) hoặc VRB-MUG:
  • E. coli: Khuẩn lạc màu đỏ với vòng tủa đục xung quanh.
• Môi trường EMB (Eosin Methylene Blue Agar):
  • E. coli: Khuẩn lạc màu xanh ánh kim.
• Môi trường TBX (Tryptone Bile X-Glucuronide Agar):
  • E. coli: Khuẩn lạc màu xanh lam.
• Ủ 37°C trong 24 giờ.

4. Kiểm tra sinh hóa

• Thử nghiệm Oxidase: Âm tính (-).
• Thử nghiệm IMViC (Indole, Methyl Red, Voges-Proskauer, Citrate):
  • Indole: Dương tính (+).
  • Methyl Red: Dương tính (+).
  • Voges-Proskauer: Âm tính (-).
  • Citrate: Âm tính (-).
• Thử nghiệm TSI (Triple Sugar Iron Agar):
  • Màu vàng/vàng, sinh hơi, không sinh H2S.
• Thử nghiệm β-glucuronidase: Dương tính với hầu hết E. coli.

5. Xác nhận bằng PCR hoặc ELISA (nếu cần)

• Dùng PCR để phát hiện gene uidA (β-glucuronidase), stx1/stx2 (độc tố Shiga của E. coli O157:H7).
• ELISA có thể sử dụng để phát hiện kháng nguyên độc tố E. coli.

6. Khẳng định và báo cáo kết quả

• Nếu phát hiện E. coli, cần đánh giá mức độ nguy cơ theo quy định của thực phẩm.
• So sánh với giới hạn vi sinh cho phép trong thực phẩm theo TCVN hoặc tiêu chuẩn quốc tế.