• SMEWW 9276: 2023: Phát hiện Shigella spp. /Detection of Shigella spp
• ISO 21567: 2004: Phát hiện Shigella spp. /Detection of Shigella spp.
• ISO 21567: 2004: Phát hiện Shigella spp. /Detection of Shigella spp.

• Selenite Broth, GN Broth (Gram-Negative Broth)
• XLD Agar (Xylose Lysine Deoxycholate Agar)
• Hektoen Enteric (HE) Agar
• MacConkey Agar

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM SHIGELLA

(Theo tiêu chuẩn ISO 21567:2004, FDA BAM Chapter 6, USP <62>, AOAC 989.14)

1. Giới thiệu về Shigella

Shigella là vi khuẩn Gram âm, thuộc họ Enterobacteriaceae, gây bệnh lỵ trực khuẩn ở người. Vi khuẩn này lây lan qua thực phẩm, nước uống bị ô nhiễm và tiếp xúc trực tiếp.

Các loài Shigella quan trọng gồm:

• Shigella dysenteriae – Gây dịch lỵ nặng
• Shigella flexneri – Phổ biến ở các nước đang phát triển
• Shigella boydii – Hiếm gặp
• Shigella sonnei – Phổ biến ở các nước phát triển

2. Tiêu chuẩn áp dụng

• ISO 21567:2004 – Phương pháp phát hiện Shigella trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi
• FDA BAM Chapter 6 – Phương pháp kiểm nghiệm Shigella trong thực phẩm
• USP <62> & AOAC 989.14 – Kiểm tra Shigella trong dược phẩm và mỹ phẩm

3. Nguyên tắc phương pháp

Có ba phương pháp chính để kiểm nghiệm Shigella:

1. Nuôi cấy trên môi trường đặc trưng – Phát hiện sự có mặt của vi khuẩn
2. Xác định sinh hóa và huyết thanh học – Định danh Shigella
3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) – Xác nhận nhanh sự có mặt của vi khuẩn

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

• Tủ ấm hiếu khí (37°C ± 1°C)
• Tủ an toàn sinh học cấp II
• Pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy, máy vortex

4.2. Môi trường nuôi cấy

• Buffered Peptone Water (BPW) – Môi trường tiền tăng sinh
• Selenite Broth, GN Broth (Gram-Negative Broth) – Môi trường giàu chọn lọc
• XLD Agar (Xylose Lysine Deoxycholate Agar) – Phân lập Shigella
• Hektoen Enteric (HE) Agar – Môi trường chọn lọc
• MacConkey Agar – Kiểm tra vi khuẩn đường ruột

5. Quy trình kiểm nghiệm

5.1. Phát hiện Shigella bằng nuôi cấy

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

• Mẫu thực phẩm: Cân 25g mẫu, pha loãng với 225mL BPW
• Mẫu nước: Lọc 100mL qua màng lọc 0.45 µm
• Mẫu bệnh phẩm: Phân, dịch hậu môn

Bước 2: Tiền tăng sinh và giàu chọn lọc

• Ủ BPW ở 37°C trong 18 – 24 giờ
• Cấy vào Selenite Broth hoặc GN Broth, ủ tiếp 37°C trong 24 giờ

Bước 3: Cấy lên môi trường chọn lọc

• Cấy vạch trên XLD Agar, HE Agar, MacConkey Agar
• Ủ 37°C trong 18 – 24 giờ

Bước 4: Kiểm tra khuẩn lạc đặc trưng

• Trên XLD Agar: Khuẩn lạc không lên men xylose, màu đỏ hồng
• Trên HE Agar: Khuẩn lạc xanh lục (không sinh H₂S)
• Trên MacConkey Agar: Khuẩn lạc không lên men lactose (màu nhạt)

📌 Ưu điểm: Tiêu chuẩn quốc tế, độ chính xác cao

5.2. Xác định sinh hóa và huyết thanh học

Bước 1: Kiểm tra sinh hóa

• TSI (Triple Sugar Iron Agar): Shigella không sinh H₂S, không lên men lactose
• Urease test: Âm tính
• Indole test: Dương tính với S. flexneri
• Motility test: Shigella không di động

Bước 2: Xác định huyết thanh học

• Sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu để xác định loài Shigella

📌 Ưu điểm: Xác định chính xác loài Shigella

5.3. Phương pháp PCR phát hiện Shigella

1. Chiết xuất DNA từ mẫu thực phẩm, nước hoặc bệnh phẩm
2. Khuếch đại gen ipaH đặc hiệu cho Shigella
3. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
4. So sánh với mẫu đối chứng dương tính và âm tính