ISO 10273 : 2003: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN YERSINIA ENTEROCOLITICA GÂY BỆNH GIẢ ĐỊNH / Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica

• Peptone Sorbitol Bile Broth (PSB)
• Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin (CIN) Agar
• MacConkey Agar
• Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) Agar
• Irgasan Ticarcillin and Potassium Chlorate Broth (ITC) ISO

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM YERSINIA ENTEROCOLITICA

(Theo tiêu chuẩn ISO 10273:2017, FDA BAM Chapter 8, USP <62>, AOAC 2003.01)

1. Giới thiệu về Yersinia enterocolitica

Yersinia enterocolitica là vi khuẩn Gram âm, thuộc họ Enterobacteriaceae, có khả năng gây viêm ruột cấp, tiêu chảy, nhiễm trùng máu. Vi khuẩn này phổ biến trong thực phẩm (thịt heo, sữa tươi), nước, động vật và môi trường lạnh.

2. Tiêu chuẩn áp dụng

• ISO 10273:2017 – Phương pháp phát hiện và định lượng Y. enterocolitica trong thực phẩm
• FDA BAM Chapter 8 – Hướng dẫn kiểm nghiệm Y. enterocolitica
• USP <62> & AOAC 2003.01 – Kiểm nghiệm trong dược phẩm, mỹ phẩm

3. Nguyên tắc phương pháp

Có ba phương pháp chính để kiểm nghiệm Y. enterocolitica:

1. Nuôi cấy trên môi trường đặc trưng – Phát hiện sự có mặt của vi khuẩn
2. Xác định sinh hóa và huyết thanh học – Định danh Y. enterocolitica
3. PCR (Polymerase Chain Reaction) – Xác định nhanh vi khuẩn

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

• Tủ ấm hiếu khí (30°C, 25°C, 37°C ± 1°C)
• Tủ an toàn sinh học cấp II
• Pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy, máy vortex

4.2. Môi trường nuôi cấy

• Peptone Sorbitol Bile Broth (PSB) – Môi trường tăng sinh
• Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin (CIN) Agar – Môi trường chọn lọc
• MacConkey Agar – Kiểm tra khả năng lên men lactose
• Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) Agar – Xác định đặc tính sinh hóa

5. Quy trình kiểm nghiệm

5.1. Phát hiện Y. enterocolitica bằng nuôi cấy

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

• Mẫu thực phẩm: Cân 25g mẫu, pha loãng với 225mL PSB
• Mẫu nước: Lọc 100mL qua màng lọc 0.45 µm
• Mẫu mỹ phẩm, dược phẩm: Hòa tan 10g mẫu vào 90mL PSB

Bước 2: Tăng sinh vi khuẩn

• Ủ PSB ở 25°C trong 48 giờ (tăng sinh lạnh)

Bước 3: Cấy lên môi trường chọn lọc

• Cấy vạch lên CIN Agar, MacConkey Agar, XLD Agar
• Ủ 30°C trong 24 – 48 giờ

Bước 4: Kiểm tra khuẩn lạc đặc trưng

• Trên CIN Agar: Khuẩn lạc đỏ, trung tâm tối (bull’s-eye colony)
• Trên MacConkey Agar: Không lên men lactose (khuẩn lạc không màu)
• Trên XLD Agar: Khuẩn lạc hồng nhạt, không sinh H₂S

📌 Ưu điểm: Tiêu chuẩn quốc tế, độ chính xác cao

5.2. Xác định sinh hóa và huyết thanh học

Bước 1: Kiểm tra sinh hóa

• Oxidase test: Âm tính
• Catalase test: Dương tính
• Indole test: Dương tính
• Urease test: Dương tính
• Motility test (nhiệt độ 25°C vs 37°C): Di động ở 25°C, không di động ở 37°C

Bước 2: Kiểm tra huyết thanh học

• Sử dụng kháng huyết thanh O3, O5, O8, O9 để xác định serotype

📌 Ưu điểm: Xác định chính xác loài Y. enterocolitica

5.3. Phương pháp PCR phát hiện Y. enterocolitica

1. Chiết xuất DNA từ mẫu thực phẩm, nước hoặc mỹ phẩm
2. Khuếch đại gen ail hoặc inv (đặc hiệu cho Y. enterocolitica)
3. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
4. So sánh với mẫu đối chứng dương tính và âm tính

📌 Ưu điểm: Phát hiện nhanh trong 24 – 48 giờ