PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM EDWARDSIELLA ICTALURI

PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM EDWARDSIELLA ICTALURI

(Theo tiêu chuẩn ISO 21872-1:2017 & AOAC 2003.09)

1. Giới thiệu về Edwardsiella ictaluri

Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn Gram âm, thuộc họ Enterobacteriaceae. Đây là tác nhân chính gây bệnh nhiễm trùng huyết và bệnh nhiễm trùng đường ruột ở cá, đặc biệt là cá da trơn (catfish).

Vi khuẩn này có thể lây nhiễm từ nước ô nhiễm sang cá nuôi và hoang dã, gây thiệt hại nghiêm trọng trong ngành thủy sản.

2. Tiêu chuẩn áp dụng

  • ISO 21872-1:2017 – Phát hiện Edwardsiella trong thực phẩm và môi trường
  • AOAC 2003.09 – Phương pháp định danh vi khuẩn Edwardsiella
  • TCVN 10780-1:2017 – Kiểm nghiệm vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản

3. Nguyên tắc phương pháp

Có 2 phương pháp chính để kiểm nghiệm Edwardsiella ictaluri:

  1. Phương pháp phát hiện định tính – Xác định sự có mặt của vi khuẩn
  2. Phương pháp định lượng (MPN – Most Probable Number) – Xác định mật độ vi khuẩn trong mẫu

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

  • Tủ ấm hiếu khí (28°C ± 1°C và 37°C ± 1°C)
  • Tủ an toàn sinh học cấp II
  • Pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy, máy vortex

4.2. Môi trường nuôi cấy

  • Tryptic Soy Broth (TSB) + NaCl 0,5% – Môi trường tăng sinh
  • Rimler-Shotts (RS) Medium – Môi trường chọn lọc đặc trưng
  • Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) Agar – Phân biệt Edwardsiella với vi khuẩn đường ruột khác
  • Triple Sugar Iron Agar (TSI) – Kiểm tra khả năng lên men đường
  • Simmons Citrate Agar – Kiểm tra khả năng sử dụng citrate

5. Quy trình kiểm nghiệm

5.1. Phát hiện định tính Edwardsiella ictaluri

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

  1. Cân 25g mẫu cá (gan, thận, ruột) hoặc nước ao, cho vào 225mL TSB + NaCl 0,5%
  2. Ủ ở 28°C trong 24 giờ

Bước 2: Cấy mẫu lên môi trường chọn lọc

  • Chuyển 1 loop mẫu từ môi trường TSB sang Rimler-Shotts (RS) Agar
  • Ủ 28°C trong 24 – 48 giờ

Bước 3: Kiểm tra khuẩn lạc đặc trưng

  • Khuẩn lạc Edwardsiella ictaluri trên RS Agar có:
    • Màu vàng do lên men glucose
    • Không sinh H₂S (âm tính với H₂S)

Bước 4: Kiểm tra sinh hóa

  • TSI Agar → Lên men glucose (+), không sinh H₂S (-)
  • Simmons Citrate Agar → Citrate (-)
  • Indole test → Indole (+)

Bước 5: Xác nhận bằng PCR hoặc ELISA (nếu cần)

5.2. Định lượng bằng phương pháp MPN

  1. Chuẩn bị 3 dãy ống nghiệm chứa môi trường TSB
  2. Cấy 10mL, 1mL, 0.1mL mẫu vào các dãy ống
  3. Ủ ở 28°C trong 24 – 48 giờ
  4. Cấy ống dương tính lên RS Agar để xác nhận
  5. Đếm số ống dương tính và tra bảng MPN để tính kết quả

6. Giới hạn vi khuẩn theo tiêu chuẩn

Sản phẩm Giới hạn Edwardsiella ictaluri
Cá giống, cá thương phẩm Không có (0 CFU/g)
Nước ao nuôi < 10² CFU/mL

7. Ứng dụng

  • Phát hiện Edwardsiella ictaluri trong cá da trơn, cá nuôi
  • Kiểm tra chất lượng nước ao, hồ
  • Giám sát dịch bệnh trong thủy sản