PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM MYCOPLASMA

PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM MYCOPLASMA

(Theo tiêu chuẩn ISO 22119:2011, USP <63>, EP 2.6.7)

1. Giới thiệu về Mycoplasma

Mycoplasma là nhóm vi khuẩn không có thành tế bào, thuộc lớp Mollicutes. Chúng có kích thước nhỏ (0,2 – 0,8 µm) và có khả năng lây nhiễm rộng trong tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật.

Một số loài Mycoplasma quan trọng:

  • Mycoplasma pneumoniae – Gây viêm phổi không điển hình
  • Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium – Gây nhiễm trùng tiết niệu, sinh dục
  • Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae – Gây bệnh ở gia cầm
  • Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans – Gây nhiễm trong phòng thí nghiệm

2. Tiêu chuẩn áp dụng

  • ISO 22119:2011 – Phát hiện và định lượng Mycoplasma trong thực phẩm
  • USP <63> & EP 2.6.7 – Kiểm tra Mycoplasma trong sản phẩm sinh học (vắc-xin, tế bào nuôi cấy, dược phẩm)
  • ISO 14698 – Kiểm soát vi sinh vật trong môi trường sản xuất

3. Nguyên tắc phương pháp

Có ba phương pháp chính để kiểm nghiệm Mycoplasma:

  1. Nuôi cấy trên môi trường đặc trưng – Xác định sự phát triển của Mycoplasma
  2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) – Xác định DNA đặc hiệu của Mycoplasma
  3. Phương pháp nhuộm huỳnh quang (DAPI, Hoechst) – Kiểm tra trực tiếp dưới kính hiển vi

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

  • Tủ ấm CO₂ (37°C, 5% CO₂)
  • Kính hiển vi huỳnh quang
  • Máy PCR (nếu dùng phương pháp PCR)

4.2. Môi trường nuôi cấy

  • Mycoplasma Broth (MB) & Mycoplasma Agar (MA) – Dùng để làm giàu và phân lập
  • SP4 Medium – Dành riêng cho Mycoplasma pneumoniae
  • Hayflick Agar – Dùng cho Mycoplasma gallisepticum
  • Indicator Medium – Kiểm tra sự thay đổi pH do Mycoplasma phát triển

5. Quy trình kiểm nghiệm

5.1. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc trưng

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

  • Đối với tế bào nuôi cấy: Ly tâm 10 mL môi trường nuôi cấy, thu lấy dịch nổi
  • Đối với thực phẩm/dược phẩm: Hòa mẫu với môi trường MB

Bước 2: Cấy mẫu vào môi trường đặc trưng

  1. Cấy 0,1 mL mẫu vào Mycoplasma Broth (MB)
  2. Ủ ở 37°C trong 5 – 7 ngày
  3. Nếu có đục nhẹ, cấy tiếp lên Mycoplasma Agar (MA)
  4. Ủ hiếu khí (hoặc có 5% CO₂) ở 37°C trong 5 – 7 ngày

Bước 3: Kiểm tra khuẩn lạc đặc trưng

  • Khuẩn lạc Mycoplasma có hình “trứng rán” (fried-egg colonies)
  • Không có thành tế bào, phát triển chậm

5.2. Phương pháp PCR phát hiện Mycoplasma

  1. Chiết xuất DNA từ mẫu tế bào hoặc thực phẩm
  2. Khuếch đại vùng gen 16S rRNA đặc hiệu của Mycoplasma
  3. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
  4. So sánh với mẫu đối chứng dương tính và âm tính

📌 Ưu điểm: Phát hiện nhanh, nhạy, không cần nuôi cấy lâu dài

5.3. Phương pháp nhuộm huỳnh quang (DAPI, Hoechst)

  1. Cố định tế bào trên lam kính
  2. Nhuộm bằng DAPI hoặc Hoechst để đánh dấu DNA của Mycoplasma
  3. Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang

📌 Ưu điểm: Phát hiện trực tiếp, không cần nuôi cấy

6. Giới hạn kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn

Mẫu kiểm nghiệm Giới hạn Mycoplasma
Vắc-xin, thuốc sinh học Không có (0 CFU/mL)
Tế bào nuôi cấy Không có (0 CFU/mL)
Thực phẩm chế biến < 10² CFU/g

7. Ứng dụng

  • Kiểm soát chất lượng vắc-xin, thuốc sinh học
  • Giám sát tế bào nuôi cấy trong nghiên cứu sinh học
  • Phát hiện Mycoplasma trong thực phẩm, nước uống