Phương pháp kiểm nghiệm tổng vi khuẩn hiếu khí

1. Tiêu chuẩn áp dụng

Phương pháp này tuân theo các tiêu chuẩn quốc tế và Việt Nam về kiểm nghiệm tổng vi khuẩn hiếu khí:

• ISO 4833-1:2013 – Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm – Phương pháp định lượng vi khuẩn hiếu khí – Phần 1: Phương pháp đổ đĩa
• ISO 4833-2:2013 – Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm – Phương pháp định lượng vi khuẩn hiếu khí – Phần 2: Phương pháp lọc màng
• TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013) – Phương pháp đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

2. Nguyên tắc

Tổng số vi khuẩn hiếu khí được xác định bằng cách nuôi cấy mẫu thử trên môi trường Plate Count Agar (PCA) hoặc môi trường thích hợp khác trong điều kiện hiếu khí, sau đó đếm số khuẩn lạc phát triển sau 24 – 48 giờ ở 30 – 37°C.

3. Dụng cụ và hóa chất

3.1. Thiết bị

• Tủ ấm vi sinh (điều chỉnh 30°C hoặc 37°C ± 1°C) – theo ISO 7218
• Tủ an toàn sinh học cấp II (nếu làm việc với mẫu có nguy cơ sinh học) – theo ISO 14644-1
• Máy lắc, máy vortex
• Tủ lạnh (-20°C đến 4°C) để bảo quản môi trường
• Pipet vô trùng, đĩa petri vô trùng, que cấy
• Máy đếm khuẩn lạc (nếu có)

3.2. Hóa chất và môi trường nuôi cấy

• Plate Count Agar (PCA) – theo ISO 4833-1
• Nước peptone 0,1% hoặc nước muối sinh lý 0,85% (dùng để pha loãng mẫu) – theo ISO 6887-1
• Dung dịch pha loãng đệm peptone (BPW) nếu cần – theo ISO 6579-1

4. Quy trình thực hiện

4.1. Chuẩn bị mẫu

• Cân 25g mẫu thực phẩm hoặc lấy 25mL mẫu nước
• Hòa mẫu vào 225mL dung dịch pha loãng peptone 0,1%
• Lắc đều trong 1-2 phút

4.2. Chuỗi pha loãng

• Tiến hành pha loãng thập phân liên tiếp (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³…) theo ISO 6887-1
• Dùng pipet vô trùng lấy 1mL hoặc 0,1mL mẫu đã pha loãng để cấy

4.3. Cấy mẫu

Phương pháp đổ đĩa (Pour Plate – ISO 4833-1)

• Lấy 1mL mẫu pha loãng cho vào đĩa petri vô trùng
• Đổ 15-20mL môi trường PCA nóng (~45°C) vào đĩa
• Lắc tròn nhẹ nhàng để mẫu phân bố đều

Phương pháp dàn đều (Spread Plate – ISO 4833-2)

• Lấy 0,1mL mẫu pha loãng nhỏ lên bề mặt thạch
• Dùng que gạt vô trùng trải đều mẫu

4.4. Ủ mẫu

• Ủ đĩa petri trong tủ ấm ở 30 ± 1°C trong 72 ± 3 giờ hoặc 37 ± 1°C trong 24 – 48 giờ
• Nếu mẫu có nền vi sinh thấp, có thể dùng phương pháp lọc màng theo ISO 8199

4.5. Đếm khuẩn lạc

• Chọn các đĩa có 30 – 300 khuẩn lạc để đếm
• Nếu dùng máy đếm khuẩn lạc, điều chỉnh độ nhạy theo ISO 7218
• Công thức tính tổng số vi khuẩn hiếu khí:

N=∑C(n1+0,1n2)×dN = \frac{\sum C}{(n_1 + 0,1 n_2) \times d}

Trong đó:

• ∑C\sum C = Tổng số khuẩn lạc đếm được
• n1n_1 = Số đĩa ở độ pha loãng thấp hơn
• n2n_2 = Số đĩa ở độ pha loãng cao hơn
• dd = Hệ số pha loãng của độ pha loãng thấp hơn

5. Đánh giá kết quả theo tiêu chuẩn

• Thực phẩm: TCVN 4884-1:2015 / ISO 4833-1:2013
• Nước uống: QCVN 6-1:2010/BYT
• Nước sinh hoạt: QCVN 01-1:2018/BYT
• Mỹ phẩm: ISO 17516:2014 (Giới hạn vi sinh trong mỹ phẩm)

Ví dụ:

• Sữa tiệt trùng: < 10 CFU/mL
• Nước uống đóng chai: < 100 CFU/mL
• Thực phẩm tươi sống: < 10⁴ CFU/g

6. Ứng dụng

• Kiểm soát chất lượng thực phẩm, nước uống, mỹ phẩm, dược phẩm
• Đánh giá mức độ vệ sinh trong sản xuất và chế biến
• Kiểm tra hiệu quả khử trùng và bảo quản