Phương pháp kiểm nghiệm tổng vi khuẩn hiếu khí

 

Chỉ tiêu Nền mẫu Giới hạn định lượng/ phạm vi đo Kỹ thuật/ Phương pháp phân tích
Định lượng tổng vi sinh vật Kỹ thuật đếm khuẩn lạc /Enumeration of culturable microorganisms Pour plate technique Nước uống đóng chai, nước khoáng, nước sạch, nước sản xuất và chế biến, nước mặt, nước nuôi trồng thủy sản, nước thải, nước đá(3),(4) /Bottled drinking water, mineral water, domestic water, processing water, surface water, water on fisheries cultivated area, waste water and ice water 1 CFU/ mL ISO 6222: 1999
Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí Kỹ thuật đếm khuẩn lạc //Enumeration of aerobic microorganism Colony count technique Thực phẩm và mẫu môi trường(3),(4) /Food and environmental samples 10 CFU/g 1 CFU/mL 10 CFU/ mẫu (Sample) ISO 4833 – 1: 2013/Amd 1: 2022
Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí Kỹ thuật đếm khuẩn lạc //Enumeration of aerobic microorganism Colony count technique Thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản(3) /Animal feed and aqua feed 10 CFU/g 1 CFU/mL ISO 4833 – 1: 2013/Amd 1: 2022
Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí Kỹ thuật đếm khuẩn lạc //Enumeration of aerobic microorganism Colony count technique Đũa ăn(3) /Chopsticks 10 CFU/g TCVN 12272: 2018
Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí Kỹ thuật đếm khuẩn lạc và lọc qua màng /Enumeration of aerobic microorganism Colony count and membrance filtration technique Đường /Sugar 10 CFU/10g 1 CFU/10mL ICUMSA GS2/3-41: 2011
Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí ở 250C, 200C, 17/70C hoặc 6.50C Kỹ thuật đếm khuẩn lạc /Enumeration of aerobic microorganism at 250C, 200C, 17/70C or 6.50C Colony count technique Thực phẩm, Thức ăn chăn nuôi, thức ăn thủy sản và mẫu môi trường /Food, Animal feed and aqua feed and environmental samples 10 CFU/g 1 CFU/mL 10 CFU/ mẫu (Sample) NMKL 86: 2013
Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí ở 350C Kỹ thuật đếm khuẩn lạc /Enumeration of aerobic microorganism at 350C Colony count technique Thực phẩm /Food 10 CFU/g 1 CFU/mL 10 CFU/ mẫu (Sample) US.FDA BAM Chapter 3: 2001
Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí ở 370C Kỹ thuật đếm khuẩn lạc //Enumeration of aerobic microorganism at 370C Colony count technique Thực phẩm và mẫu môi trường(3),(4) /Food and environmental samples 10 CFU/g 1 CFU/mL 10 CFU/ mẫu (Sample) NMKL 86: 2013
Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí ở 370C Kỹ thuật đếm khuẩn lạc //Enumeration of aerobic microorganism at 370C Colony count technique Thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản(3) /Animal feed and aqua feed 10 CFU/g 1 CFU/mL 10 CFU/ mẫu (Sample) NMKL 86: 2013

 

Phương pháp kiểm nghiệm tổng vi khuẩn hiếu khí

1. Tiêu chuẩn áp dụng

Phương pháp này tuân theo các tiêu chuẩn quốc tế và Việt Nam về kiểm nghiệm tổng vi khuẩn hiếu khí:

  • ISO 4833-1:2013 – Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm – Phương pháp định lượng vi khuẩn hiếu khí – Phần 1: Phương pháp đổ đĩa
  • ISO 4833-2:2013 – Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm – Phương pháp định lượng vi khuẩn hiếu khí – Phần 2: Phương pháp lọc màng
  • TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013) – Phương pháp đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

2. Nguyên tắc

Tổng số vi khuẩn hiếu khí được xác định bằng cách nuôi cấy mẫu thử trên môi trường Plate Count Agar (PCA) hoặc môi trường thích hợp khác trong điều kiện hiếu khí, sau đó đếm số khuẩn lạc phát triển sau 24 – 48 giờ ở 30 – 37°C.

3. Dụng cụ và hóa chất

3.1. Thiết bị

  • Tủ ấm vi sinh (điều chỉnh 30°C hoặc 37°C ± 1°C) – theo ISO 7218
  • Tủ an toàn sinh học cấp II (nếu làm việc với mẫu có nguy cơ sinh học) – theo ISO 14644-1
  • Máy lắc, máy vortex
  • Tủ lạnh (-20°C đến 4°C) để bảo quản môi trường
  • Pipet vô trùng, đĩa petri vô trùng, que cấy
  • Máy đếm khuẩn lạc (nếu có)

3.2. Hóa chất và môi trường nuôi cấy

  • Plate Count Agar (PCA) – theo ISO 4833-1
  • Nước peptone 0,1% hoặc nước muối sinh lý 0,85% (dùng để pha loãng mẫu) – theo ISO 6887-1
  • Dung dịch pha loãng đệm peptone (BPW) nếu cần – theo ISO 6579-1

4. Quy trình thực hiện

4.1. Chuẩn bị mẫu

  • Cân 25g mẫu thực phẩm hoặc lấy 25mL mẫu nước
  • Hòa mẫu vào 225mL dung dịch pha loãng peptone 0,1%
  • Lắc đều trong 1-2 phút

4.2. Chuỗi pha loãng

  • Tiến hành pha loãng thập phân liên tiếp (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³…) theo ISO 6887-1
  • Dùng pipet vô trùng lấy 1mL hoặc 0,1mL mẫu đã pha loãng để cấy

4.3. Cấy mẫu

Phương pháp đổ đĩa (Pour Plate – ISO 4833-1)

  • Lấy 1mL mẫu pha loãng cho vào đĩa petri vô trùng
  • Đổ 15-20mL môi trường PCA nóng (~45°C) vào đĩa
  • Lắc tròn nhẹ nhàng để mẫu phân bố đều

Phương pháp dàn đều (Spread Plate – ISO 4833-2)

  • Lấy 0,1mL mẫu pha loãng nhỏ lên bề mặt thạch
  • Dùng que gạt vô trùng trải đều mẫu

4.4. Ủ mẫu

  • Ủ đĩa petri trong tủ ấm ở 30 ± 1°C trong 72 ± 3 giờ hoặc 37 ± 1°C trong 24 – 48 giờ
  • Nếu mẫu có nền vi sinh thấp, có thể dùng phương pháp lọc màng theo ISO 8199

4.5. Đếm khuẩn lạc

  • Chọn các đĩa có 30 – 300 khuẩn lạc để đếm
  • Nếu dùng máy đếm khuẩn lạc, điều chỉnh độ nhạy theo ISO 7218
  • Công thức tính tổng số vi khuẩn hiếu khí:

N=∑C(n1+0,1n2)×dN = \frac{\sum C}{(n_1 + 0,1 n_2) \times d}

Trong đó:

  • ∑C\sum C = Tổng số khuẩn lạc đếm được
  • n1n_1 = Số đĩa ở độ pha loãng thấp hơn
  • n2n_2 = Số đĩa ở độ pha loãng cao hơn
  • dd = Hệ số pha loãng của độ pha loãng thấp hơn

5. Đánh giá kết quả theo tiêu chuẩn

  • Thực phẩm: TCVN 4884-1:2015 / ISO 4833-1:2013
  • Nước uống: QCVN 6-1:2010/BYT
  • Nước sinh hoạt: QCVN 01-1:2018/BYT
  • Mỹ phẩm: ISO 17516:2014 (Giới hạn vi sinh trong mỹ phẩm)

Ví dụ:

  • Sữa tiệt trùng: < 10 CFU/mL
  • Nước uống đóng chai: < 100 CFU/mL
  • Thực phẩm tươi sống: < 10⁴ CFU/g

6. Ứng dụng

  • Kiểm soát chất lượng thực phẩm, nước uống, mỹ phẩm, dược phẩm
  • Đánh giá mức độ vệ sinh trong sản xuất và chế biến
  • Kiểm tra hiệu quả khử trùng và bảo quản