PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI KHUẨN AEROMONAS SPP

Chỉ tiêu Nền mẫu Giới hạn định lượng/ phạm vi đo Kỹ thuật/ Phương pháp phân tích
Định lượng Aeromonas spp. Phương pháp lọc qua màng /Enumeration of Aeromonas spp. Membrane filtration method Nước uống đóng chai, nước khoáng, nước sạch, nước sản xuất và chế biến, nước mặt, nước nuôi trồng thủy sản, nước đá(3) /Bottled drinking water, mineral water, domestic water, processing water, surface water, water on fisheries cultivated area and ice water 1 CFU/ 100 mL 1CFU/ 250mL SMEWW 9260 (L): 2017
hát hiện Vi khuẩn Aeromonas hydrophyla Kỹ thuật PCR /Detection of Aeromonas hydrophyla PCR technique Cá, nước nuôi trồng thủy sản Fish, water on fisheries cultivated area 15 copies/phản ứng (reaction) TCVN 8710 – 15: 2015

PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI KHUẨN AEROMONAS SPP.

(Theo tiêu chuẩn ISO 16266-2:2018 & TCVN 10727:2015)

1. Giới thiệu về Aeromonas spp.

Aeromonas là một nhóm vi khuẩn gram âm, có khả năng gây bệnh đường tiêu hóa và nhiễm trùng vết thương. Chúng phổ biến trong nước ngọt, nước thải, thực phẩm tươi sống (hải sản, thịt gia cầm), và môi trường bệnh viện.

2. Tiêu chuẩn áp dụng

  • ISO 16266-2:2018 – Xác định Aeromonas spp. trong nước bằng phương pháp lọc màng
  • ISO 17995:2005 – Phát hiện và định lượng Aeromonas spp. trong nước
  • TCVN 10727:2015 – Phương pháp phát hiện và định lượng Aeromonas spp. trong thực phẩm

3. Nguyên tắc phương pháp

Có 3 phương pháp phổ biến để kiểm nghiệm Aeromonas spp.:

  1. Phương pháp lọc màng (Membrane Filtration – ISO 16266-2) – Áp dụng cho mẫu nước
  2. Phương pháp cấy trực tiếp trên môi trường chọn lọc – Áp dụng cho thực phẩm, nước, mẫu môi trường
  3. Phương pháp MPN (Most Probable Number) – Dùng để định lượng khi vi khuẩn có mật độ thấp

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

  • Tủ ấm vi sinh (35 – 37°C ± 1°C) – Theo ISO 7218
  • Tủ an toàn sinh học cấp II – Nếu làm việc với mẫu có nguy cơ cao
  • Máy lọc màng và màng lọc (0,45 µm) – Nếu áp dụng phương pháp lọc màng
  • Pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy
  • Máy đếm khuẩn lạc (nếu có)

4.2. Môi trường nuôi cấy

  • Ampicillin Dextrin Agar (ADA) – Chuyên biệt cho Aeromonas spp.
  • Ryan Medium Base (RMB) hoặc Starch Ampicillin Agar (SAA) – Môi trường chọn lọc
  • Alkaline Peptone Water (APW, pH 8.5) – Môi trường làm giàu
  • Tryptic Soy Agar (TSA) – Môi trường tăng sinh
  • Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS) – Phân biệt với Vibrio spp.

5. Quy trình thực hiện

5.1. Phương pháp lọc màng (ISO 16266-2:2018) – Dành cho mẫu nước

  1. Chuẩn bị mẫu: Lọc 100 – 500 mL nước qua màng lọc 0,45 µm
  2. Chuyển màng lọc lên môi trường ADA hoặc RMB
  3. Ủ ở 37°C trong 24 ± 2 giờ
  4. Đếm khuẩn lạc màu vàng nhạt hoặc xanh lá trên ADA
  5. Xác nhận bằng thử nghiệm sinh hóa (Oxidase dương, Ferment Glucose, β-Hemolysis trên BA, Indole dương/âm)

5.2. Phương pháp cấy trực tiếp – Dành cho thực phẩm, nước, môi trường

  1. Cân 25g mẫu thực phẩm, pha loãng với 225mL nước peptone (BPW)
  2. Lắc đều, ủ sơ bộ 6 – 18 giờ ở 30°C
  3. Cấy mẫu lên môi trường chọn lọc (ADA, RMB, hoặc TCBS)
  4. Ủ ở 37°C trong 24 – 48 giờ
  5. Xác định khuẩn lạc đặc trưng (trên ADA: khuẩn lạc vàng nhạt; trên TCBS: khuẩn lạc xanh không lên men sucrose)
  6. Xác nhận bằng sinh hóa (Oxidase, Glucose, Indole, Hemolysis trên BA)

5.3. Phương pháp MPN – Định lượng Aeromonas spp.

  1. Chuẩn bị 3 dãy ống nghiệm chứa môi trường APW
  2. Cấy 10mL, 1mL, và 0.1mL mẫu vào các dãy ống tương ứng
  3. Ủ ở 30°C trong 18 – 24 giờ
  4. Chuyển ống dương tính sang môi trường chọn lọc (ADA, RMB)
  5. Ủ ở 37°C trong 24 giờ và xác định khuẩn lạc đặc trưng
  6. Dùng bảng MPN để tính kết quả

6. Xác nhận kết quả

6.1. Đặc điểm sinh hóa của Aeromonas spp.:

  • Oxidase (+)
  • Catalase (+)
  • Glucose lên men (+)
  • Indole (+) hoặc (-) tùy loài
  • Beta-hemolysis trên Blood Agar (BA) (+)

6.2. Giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn

Sản phẩm Tiêu chuẩn Giới hạn Aeromonas spp. (CFU/g hoặc CFU/mL)
Nước uống QCVN 6-1:2010/BYT Không có (0 CFU/100mL)
Nước sinh hoạt QCVN 01-1:2018/BYT < 1 CFU/100mL
Hải sản tươi sống TCVN 10727:2015 < 10³ CFU/g
Thực phẩm chế biến sẵn ISO 17995 Không có

7. Ứng dụng

  • Kiểm tra an toàn vi sinh thực phẩm, nước uống
  • Kiểm tra hệ thống xử lý nước và môi trường y tế
  • Giám sát dịch tễ học liên quan đến nhiễm khuẩn Aeromonas spp.