PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI KHUẨN AEROMONAS SPP

• SMEWW 9260 (L): 2017: Định lượng Aeromonas spp. Phương pháp lọc qua màng /Enumeration of Aeromonas spp. Membrane filtration method
• TCVN 8710 – 15: 2015: Phát hiện Vi khuẩn Aeromonas hydrophyla Kỹ thuật PCR /Detection of Aeromonas hydrophyla PCR technique

• Ampicillin Dextrin Agar (ADA)
• Ryan Medium Base (RMB)
• Starch Ampicillin Agar (SAA)
• Alkaline Peptone Water (APW, pH 8.5)
• Tryptic Soy Agar (TSA)
• Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS)

PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI KHUẨN AEROMONAS SPP.

(Theo tiêu chuẩn ISO 16266-2:2018 & TCVN 10727:2015)

1. Giới thiệu về Aeromonas spp.

Aeromonas là một nhóm vi khuẩn gram âm, có khả năng gây bệnh đường tiêu hóa và nhiễm trùng vết thương. Chúng phổ biến trong nước ngọt, nước thải, thực phẩm tươi sống (hải sản, thịt gia cầm), và môi trường bệnh viện.

2. Tiêu chuẩn áp dụng

• ISO 16266-2:2018 – Xác định Aeromonas spp. trong nước bằng phương pháp lọc màng
• ISO 17995:2005 – Phát hiện và định lượng Aeromonas spp. trong nước
• TCVN 10727:2015 – Phương pháp phát hiện và định lượng Aeromonas spp. trong thực phẩm

3. Nguyên tắc phương pháp

Có 3 phương pháp phổ biến để kiểm nghiệm Aeromonas spp.:

1. Phương pháp lọc màng (Membrane Filtration – ISO 16266-2) – Áp dụng cho mẫu nước
2. Phương pháp cấy trực tiếp trên môi trường chọn lọc – Áp dụng cho thực phẩm, nước, mẫu môi trường
3. Phương pháp MPN (Most Probable Number) – Dùng để định lượng khi vi khuẩn có mật độ thấp

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

• Tủ ấm vi sinh (35 – 37°C ± 1°C) – Theo ISO 7218
• Tủ an toàn sinh học cấp II – Nếu làm việc với mẫu có nguy cơ cao
• Máy lọc màng và màng lọc (0,45 µm) – Nếu áp dụng phương pháp lọc màng
• Pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy
• Máy đếm khuẩn lạc (nếu có)

4.2. Môi trường nuôi cấy

• Ampicillin Dextrin Agar (ADA) – Chuyên biệt cho Aeromonas spp.
• Ryan Medium Base (RMB) hoặc Starch Ampicillin Agar (SAA) – Môi trường chọn lọc
• Alkaline Peptone Water (APW, pH 8.5) – Môi trường làm giàu
• Tryptic Soy Agar (TSA) – Môi trường tăng sinh
• Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS) – Phân biệt với Vibrio spp.

5. Quy trình thực hiện

5.1. Phương pháp lọc màng (ISO 16266-2:2018) – Dành cho mẫu nước

1. Chuẩn bị mẫu: Lọc 100 – 500 mL nước qua màng lọc 0,45 µm
2. Chuyển màng lọc lên môi trường ADA hoặc RMB
3. Ủ ở 37°C trong 24 ± 2 giờ
4. Đếm khuẩn lạc màu vàng nhạt hoặc xanh lá trên ADA
5. Xác nhận bằng thử nghiệm sinh hóa (Oxidase dương, Ferment Glucose, β-Hemolysis trên BA, Indole dương/âm)

5.2. Phương pháp cấy trực tiếp – Dành cho thực phẩm, nước, môi trường

1. Cân 25g mẫu thực phẩm, pha loãng với 225mL nước peptone (BPW)
2. Lắc đều, ủ sơ bộ 6 – 18 giờ ở 30°C
3. Cấy mẫu lên môi trường chọn lọc (ADA, RMB, hoặc TCBS)
4. Ủ ở 37°C trong 24 – 48 giờ
5. Xác định khuẩn lạc đặc trưng (trên ADA: khuẩn lạc vàng nhạt; trên TCBS: khuẩn lạc xanh không lên men sucrose)
6. Xác nhận bằng sinh hóa (Oxidase, Glucose, Indole, Hemolysis trên BA)

5.3. Phương pháp MPN – Định lượng Aeromonas spp.

1. Chuẩn bị 3 dãy ống nghiệm chứa môi trường APW
2. Cấy 10mL, 1mL, và 0.1mL mẫu vào các dãy ống tương ứng
3. Ủ ở 30°C trong 18 – 24 giờ
4. Chuyển ống dương tính sang môi trường chọn lọc (ADA, RMB)
5. Ủ ở 37°C trong 24 giờ và xác định khuẩn lạc đặc trưng
6. Dùng bảng MPN để tính kết quả

6. Xác nhận kết quả

6.1. Đặc điểm sinh hóa của Aeromonas spp.:

• Oxidase (+)
• Catalase (+)
• Glucose lên men (+)
• Indole (+) hoặc (-) tùy loài
• Beta-hemolysis trên Blood Agar (BA) (+)