Phương pháp phát hiện Shigella spp

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8131 : 2009

ISO 21567 : 2004

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SHIGELLA SPP.

Microbiology of food and animal feeding stuff – Horizontal method for the detection of Shigella spp.

Lời nói đầu

TCVN 8131 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 21567 : 2004;

TCVN 8131 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Lời giới thiệu

Do tính đa dạng của thực phẩm và thức ăn chăn nuôi nên phương pháp này có thể không thích hợp đến từng chi tiết cho từng sản phẩm cụ thể. Trong trường hợp này, có thể sử dụng các phương pháp khác đặc trưng cho từng sản phẩm, nếu hoàn toàn chỉ vì lý do kỹ thuật. Tuy nhiên, cần cố gắng áp dụng phương pháp này khi có thể.

Khi tiêu chuẩn này được soát xét tiếp thì cần phải tính đến mọi thông tin sẵn có liên quan đến phạm vi mà phương pháp đếm đĩa này đã được tiến hành và các nguyên nhân gây sai lệch so với phương pháp trong trường hợp các sản phẩm cụ thể.

Việc hài hòa các phương pháp thử có thể không thực hiện được ngay và đối với một vài nhóm sản phẩm có thể tồn tại các tiêu chuẩn và/hoặc tiêu chuẩn quốc gia mà không phù hợp với tiêu chuẩn này. Trong trường hợp có sẵn tiêu chuẩn sản phẩm cần thử nghiệm thì phải tuân theo tiêu chuẩn đó. Thông thường, khi các tiêu chuẩn nói trên được soát xét, thì chúng sẽ phải được sửa đổi để phù hợp với tiêu chuẩn này, sao cho cuối cùng các sai lệch với phương pháp đếm đĩa này chỉ còn là các lý do kỹ thuật thật cần thiết.

 

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SHIGELLA SPP.

Microbiology of food and animal feeding stuff – Horizontal method for the detection of Shigella spp.

CẢNH BÁO – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể cần phải sử dụng các vật liệu, thiết bị và các thao tác nguy hiểm. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn qui định trước khi sử dụng tiêu chuẩn. Thận trọng khi thải bỏ tất cả các vật liệu lây nhiễm.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp phát hiện Shigella spp.

Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:

– các sản phẩm dùng cho con người và dùng làm thức ăn chăn nuôi;

– các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6263 (ISO 8261), Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn chung về chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật.

TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và trong thức ăn chăn nuôi – Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật.

TCVN 6507-1 (ISO 6887-1), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân.

TCVN 6507-2 (ISO 6887-2), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 2: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các mẫu thịt và sản phẩm thịt.

TCVN 6507-3 (ISO 6887-3), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử dung dịch huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 3: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản.

TCVN 6507-4 (ISO 6887-4), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 4: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các sản phẩm khác với sữa và sản phẩm sữa, thịt và sản phẩm thịt, thủy sản và sản phẩm thủy sản.

TCVN 8128-1 : 2009 (ISO/TS 11133-1 : 2009), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Hướng dẫn chuẩn bị và sản xuất môi trường cấy – Phần 1: Các hướng dẫn chung về đảm bảo chất lượng cho việc chuẩn bị môi trường cấy trong phòng thử nghiệm.

TCVN 8128-2 : 2009 (ISO/TS 11133-2 : 2009), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Hướng dẫn chuẩn bị và sản xuất môi trường cấy – Phần 2: Các hướng dẫn thực hành về thử hiệu năng của môi trường cấy.

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1. Shigella (shigella)

Các vi sinh vật tạo thành các khuẩn lạc phù hợp với các mô tả của các loài trên môi trường chọn lọc đặc được sử dụng, và cho thấy có các đặc tính sinh hóa vào huyết thanh học như mô tả trong phép thử được thực hiện theo tiêu chuẩn này.

3.2. Phát hiện Shigella spp. (detection of Shighella spp.)

Xác định sự có mặt hay không có mặt các vi sinh vật này trong một phần khối lượng cụ thể của mẫu thử khi các phép thử được tiến hành theo tiêu chuẩn này.

4. Nguyên tắc

4.1. Yêu cầu chung

Việc phát hiện Shigella cần đến bốn giai đoạn liên tiếp (xem Phụ lục A).

4.2. Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc

Phần mẫu thử được cấy vào canh thang Shigella có chứa novobioxin 0,5 µg/ml, rồi được ủ kỵ khí ở 41,5 ^oC ± 1 ^oC trong 16 h đến 20 h.

4.3. Đổ đĩa và nhận biết các khuẩn lạc

Cấy các dịch cấy tăng sinh thu được vào ba môi trường phân biệt chọn lọc: thạch MacConkey có tính chọn lọc thấp; thạch XLD có tính chọn lọc trung bình và thạch Hektoen có độ nhạy cao nhất. Tất cả các đĩa này được ủ ở 37 ^oC trong 20 h đến 24 h.

4.4. Khẳng định bằng sinh hóa và huyết thanh học

Chọn các khuẩn lạc điển hình và nghi ngờ trong mỗi môi trường từ ba môi trường thạch chọn lọc. Các khuẩn lạc này được cấy thuần khiết trên thạch dinh dưỡng, rồi tiến hành các phép thử sinh hóa và huyết thanh học như mô tả.

5. Môi trường nuôi cấy, và thuốc thử và kháng huyết thanh (antisera)

Về thực hành các phòng thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 6404 (ISO 7218) và TCVN 8128-1 : 2009 (ISO/TS 11133-1 : 2009) và TCVN 8128-2 : 2009 (ISO/TS 11133-2 : 2003) về cách chuẩn bị, sản xuất và thử nghiệm hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có qui định khác.

Xem Phụ lục B về mô tả tất cả các môi trường, thuốc thử và kháng huyết thanh.

Các môi trường khô bán sẵn phải cho các kết quả ổn định hơn so với các kết quả của các môi trường được chuẩn bị từ các thành phần của chúng trong phòng thử nghiệm. Thực hiện chính xác các hướng dẫn của nhà sản xuất, vì các thay đổi nhỏ trong việc chuẩn bị có thể làm thay đổi đáng kể hiệu năng của môi trường. Việc làm nóng quá mức các môi trường thạch chọn lọc do hấp áp lực, bảo quản rồi làm nóng lại để sử dụng có thể làm giảm độ nhạy của môi trường.

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Có thể dùng thiết bị, dụng cụ dùng một lần thay cho việc sử dụng lại các dụng cụ thủy tinh nếu chúng có các qui định kỹ thuật tương tự.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm phân tích vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:

6.1. Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

6.2. Tủ sấy hoặc lò sấy, được thông gió đối lưu, có khả duy trì nhiệt độ ở 37 ^oC đến 55 ^oC.

6.3. Tủ ấm, có khả duy trì nhiệt độ ở 37 ^oC ± 1 ^oC và 41,5 ^oC ± 1 ^oC.

6.4. Bình có môi trường cải biến hoặc tủ cấy kỵ khí và các thiết bị liên quan để đạt được các điều kiện kỵ khí có thành phần khí như O₂ < 1 % và CO₂ từ 9 % đến 13 %. Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

6.5. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 47 ^oC ± 3 ^oC để làm tan chảy môi trường trước khi đổ đĩa và một nồi cách thủy khác duy trì nhiệt độ ở 50 ^oC ± 1 ^oC (Xem B.6.3.2 và B.10.2.2).

6.6. Bộ đồng hóa kiểu nhu động (dạng túi) hoặc máy trộn quay.

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

6.7. Kim cấy và que cấy vòng, bằng platin/iridi hoặc niken/crom có đường kính khoảng 3 mm hoặc các kim cấy và que cấy vòng bằng chất dẻo sử dụng một lần có các yêu cầu thích hợp.

6.8. Máy đo pH, chính xác hiệu chuẩn đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 ^oC.

6.9. Bình cầu hoặc chai, có nắp đậy, có dung tích thích hợp cho việc chuẩn bị và bảo quản các canh thang tăng sinh và thạch.

6.10. Ống đong

6.11. Ống nghiệm, có đường kính khoảng 18 mm, dài 160 mm (có nút đậy hoặc nắp vặn), hoặc chai cấy có dung tích danh định 30 ml và 10 ml, có nắp đậy bằng kim loại không độc có lớp lót hoặc nắp đậy bằng chất dẻo dùng một lần.

6.12. Đĩa Petri, có đường kính từ 90 mm đến 100 mm và loại khác có đường kính 140 mm.

6.10. Phiến kính hoặc tấm kính, thích hợp cho các phép thử sự ngưng kết.

7. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

8. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo phần thích hợp của TCVN 6507 (ISO 6887) và/hoặc TCVN 6263 (ISO 8261).

Phân tích mẫu càng nhanh càng tốt vì sự sống sót của Shigella là rất yếu.

9. Cách tiến hành (Xem sơ đồ trong Phụ lục A)

9.1. Phần mẫu thử

Xem phần thích hợp của TCVN 6507 (ISO 6887) và/hoặc TCVN 6263 (ISO 8261) tùy thuộc vào sản phẩm có liên quan.

9.2. Tăng sinh

Cho x g hoặc x ml phần mẫu thử vào 9x ml canh thang Shigella chứa novobioxin 0,5 µg/ml (B.1.2) để tạo dung dịch huyền phù mẫu thử 1:10. Đồng hóa phần mẫu thử trong canh thang dùng bộ đồng hóa kiểu nhu động hoặc máy trộn quay (6.6). Chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 một cách vô trùng, nếu cần.

Ủ canh thang Shigella trong các điều kiện kỵ khí (6.4) có nắp đậy và nới lỏng nắp, hoặc có bộ phận cho hiệu quả tương đương, sao cho việc trao đổi khí có thể dễ dàng xảy ra mà không bị nhiễm bẩn ở nhiệt độ 41,5 ^oC ± 1 ^oC (6.3) trong 16 h đến 20 h.

9.3. Đổ đĩa và chọn khuẩn lạc

9.3.1. Dùng dịch cấy thu được trong 9.2, lắc nhẹ nhàng bằng tay để trộn mẫu và để cho các hạt to lắng xuống.

Dùng que cấy vòng (6.7) cấy lên bề mặt các đĩa đựng môi trường thạch chọn lọc sau đây: thạch MacConkey (B.2.1) có tính chọc lọc thấp; thạch XLD (B.2.2) có tính chọn lọc trung bình và thạch Hektoen (B.2.3) có độ nhạy cao nhất, để thu được các khuẩn lạc mọc tách biệt tốt:

9.3.2. Ủ các đĩa trong tủ (6.3) ở 37 ^oC ± 1 ^oC trong 20 h đến 24 h.

9.3.3. Sự thể hiện bên ngoài của các loài Shigella khác nhau thay đổi trên cùng một đĩa thạch chọn lọc. Xem Phụ lục C về mô tả các khuẩn lạc Shigella trên các đĩa thạch phân biệt chọn lọc được sử dụng.

Các loài Shigella có thể tạo thành một tỷ lệ nhỏ hệ vi khuẩn tổng số khi có sự nhiễm bẩn mẫu thực phẩm hoặc sau khi tăng sinh. Trong trường hợp này, việc cấy vạch trực tiếp canh thang tăng sinh lên một đĩa thạch chọn lọc có thể làm cho phát hiện sai các khuẩn lạc Shigella. Do đó, khi thích hợp (ví dụ: phát hiện thực phẩm gây ngộ độc) cần xem xét nuôi cấy hai đĩa Petri đường kính 90 mm hoặc một đĩa Petri lớn (140 mm) (6.12) để tăng khả năng phát hiện.

Vẻ bên ngoài của một số khuẩn lạc của một số chủng Enterobacteriacea giống với các khuẩn lạc Shigella. Mọi khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đều phải được khẳng định (xem 9.4) xem có phải là các loài Shigella hay không. Cũng trong một số trường hợp (ví dụ: thực phẩm gây ngộ độc), thì có thể kiểm tra nhiều hơn năm khuẩn lạc từ một đĩa để tăng mức độ tin cậy về việc không có mặt Shigella trong mẫu thực phẩm được thử nghiệm.

Đánh dấu tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ tìm thấy trên mỗi đĩa.

Nếu không thấy khuẩn lạc nào điển hình và các vi sinh vật khác mọc yếu (cụ thể là trên thạch có độ nhạy cao nhất), thì ủ lại các đĩa thêm 24 h. Kiểm tra lại các đĩa này về các khuẩn lạc Shigella điển hình.

Tiến hành qui trình khẳng định như trong 9.4.

9.4. Khẳng định các khuẩn lạc

9.4.1. Yêu cầu chung

Có thể sử dụng các bộ thử nhận biết (có bán sẵn) được người sử dụng cho thấy đáng tin cậy về sự nhận biết các loài Shigella khác nhau. Thực hiện chính xác theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Để khẳng định, cấy truyền từ mỗi đĩa đựng từng môi trường chọn lọc (xem 9.3) năm khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đã đánh dấu.

Nếu trên một đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ, thì lấy tất cả các khuẩn lạc có mặt để thử khẳng định.

Sử dụng dịch cấy thuần khiết để khẳng định sinh hóa và huyết thanh.

9.4.2. Cấy thuần khiết các khuẩn lạc

Cấy vạch các khuẩn lạc đã chọn lên bề mặt các đĩa thạch dinh dưỡng (B.3) sao cho thu được các khuẩn lạc mọc tách biệt tốt.

Ủ các đĩa trong tủ (6.3) ở 37 ^oC ± 1 ^oC trong 18 h đến 24 h.

Nếu các khuẩn lạc trên thạch dinh dưỡng mọc lẫn thì cấy truyền một khuẩn lạc nghi ngờ lên một đĩa thạch dinh dưỡng khác và ủ ở 37 ^oC ± 1 ^oC trong 18 h đến 24 h để thu được khuẩn lạc thuần khiết.

Shigella sonnei có thể cho hai kiểu khuẩn lạc trên cùng một đĩa thạch: khuẩn lạc dạng lồi, tròn, trơn nhẵn (giai đoạn 1) và khuẩn lạc dẹt không đều có bề mặt mờ đục (giai đoạn 2).

CHÚ THÍCH: Nếu có thể, trước tiên thử khuẩn lạc đặc trưng nhất từ mỗi đĩa thạch chọn lọc. Nếu dương tính, thì không cần thiết phải kiểm tra các khuẩn lạc khác. Nếu âm tính, thì tiến hành kiểm tra các khuẩn lạc khác cho đến khi tìm thấy tất cả là âm tính hoặc dương tính.

9.4.3. Khẳng định sinh hóa

9.4.3.1. Yêu cầu chung

Dùng kim cấy (6.7) cấy dịch cấy thu được trong 9.4.1 vào môi trường qui định trong 9.4.3.2 đến 9.4.3.9 và ghi lại các kết quả.

9.4.3.2. Thạch sắt ba đường (thạch nghiêng TSI) (B.4)

Cấy đâm sâu và cấy vạch trên bề mặt thạch nghiêng.

Ủ các đĩa trong tủ (6.3) ở 37 ^oC ± 1 ^oC trong 24 h ± h.

Diễn giải các thay đổi trong môi trường như sau:

Vùng cấy	Bề ngoài	Cho thấy
Cấy đâm sâu	Màu vàng Màu đỏ hoặc không đổi màu Màu đen Có bọt khí hoặc rạn nứt	Lên men glucoza: dương tính Không lên men glucoza: âm tính Sinh hydro sulfua: dương tính Sinh khí
Cấy bề mặt nghiêng	Màu vàng Màu đỏ hoặc không đổi màu	Sử dụng lactoza và/hoặc sacaroza: dương tính Không sử dụng lactoza và sacaroza: âm tính

Các chủng cấy Shigella điển hình cho thấy có màu vàng khi cấy đâm sâu (sinh axit) và không có bọt khí, không đổi màu khi cấy bề mặt nghiêng (không sử dụng lactoza hoặc sacaroza) và không sinh hydro sulfua (xem Bảng 1).

9.4.3.3. Thạch dinh dưỡng nửa đặc để dùng cho các phép thử tính di động (B.5)

Dùng kim cấy (6.7) cấy đâm sâu một khuẩn lạc vào thạch dinh dưỡng nửa đặc.

Ủ trong tủ (6.3) ở 37 ^oC ± 1 ^oC trong 18 h đến 24 h.

Kiểm tra đường cấy về sự phát triển lan rộng. Các vi sinh vật không di động sẽ cho đường rời rạc; các chủng di động sẽ phát triển phân tán xung quanh đường cấy.

Tất cả các loài Shigella là không di động.

9.4.3.4. Thạch ure (B.6)

Cấy ria trên bề mặt thạch.

Ủ trong tủ (6.3) ở 37 ^oC ± 1 ^oC trong 24 h ± 3 h.

Nếu ure bị thủy phân, thì sẽ có màu hồng đến hồng đậm do giải phóng amoniac từ việc phân hủy ure với sự đổi màu của chất chỉ thị pH. Khi không có sự đổi màu của thạch chứng tỏ phản ứng âm tính.

Các loài Shigella không thủy phân ure.

9.4.3.5. Môi trường L-Lysin decacboxylaza (B.7)

Cấy ngay phía dưới bề mặt của canh thang.

Ủ trong tủ (6.3) ở 37 ^oC ± 1 ^oC trong 24 h ± 3 h.

Sau khi ủ thấy đục và đỏ tía chứng tỏ phản ứng dương tính. Màu vàng là phản ứng âm tính.

Các loài Shigella không khử nhóm carboxyl của lysin

CHÚ THÍCH: Sử dụng parafin phủ lên trên các ống có thể đảm bảo được các điều kiện kỵ khí.

9.4.3.6. Môi trường L-Ornithin decacboxylaza (B.8)

Cấy dưới bề mặt canh thang.

Ủ trong tủ (6.3) ở 37 ^oC ± 1 ^oC trong 24 h ± 3 h.

Sau khi ủ có màu đỏ tía chứng tỏ phản ứng dương tính; màu vàng chứng tỏ phản ứng âm tính.

Shigella sonnei khử nhóm carboxyl của ornithin, còn các loài Shigella khác thì không (xem Bảng 1).

Bảng 1 – Khẳng định và phân biệt bằng sinh hóa các loài Shigella với Escheriachia coll, các loài Hafnia và Providencia

Phép thử	Escherichia coli	Các loài Hafnia	Providencia	Shigella sonnei	Shigella flexneri	Shigella dysenteriae	Shigella bodil
Sinh H2S từ TSI	–	–	–	–	–	–	–
Sinh khí từ glucoza (TSI)	+	V	+	–	–	–e	–e
Tính di động	+	V	V	–	–	–	–
Ureaza	–	–	V	–	–	–	–
L-Lysin decacboxylaza	V	+	–	–	–	–	–i
L-Ornithin decacboxylaza	V	+	–	+	–	–	–
Sinh indol	+	–	+	–	Vd (61 %)	Vd (44 %)	Vd (29 %)
β-galactosidaza	+	V	–	+ (95 %)	–	Vf (50 %)	Vf (11 %)
Axit từ:
Dulcitol	V	V	–	–	Vg (9,4 %)	Vg (4,5 %)	Vg (6,7 %)
Glucoza	+	+	–	+(100 %)	+ (100 %)	+ (100 %)	+ (100 %)
Lactoza	V	V	–	–c	–a	–	–a
Mannitol	+	+	V	+ (99 %)	+ b (94 %)	–	+ (98 %)
Melibioza	V	V	V	–	V	V	V
Raffinoza	V	V	–	–c (25 %)	V (53 %)	–	–
Salixin	V	V	–	–	–	–	–
Sorbitol	+	–	–	–	V (31 %)	V (29 %)	V (42 %)
Sacaroza	V	–	V	–c (15 %)	–	–	–
Xyloza	+	+	–	–	–	Vh (4,0 %)	V (57 %)
V: các chủng khác nhau trong hoặc giữa các serovar của loài và khi đưa ra theo (x %) cho thấy phần trăm các chủng dương tính[1]). a một số chủng S. flexneri serovar 2a và S. boydii 9 sinh axit. b một số chủng S. flexneri serovar 4 và 6b không sinh axit. c Shigella sonnei sinh axit sau khi ủ vài ngày. d một số chủng Shigella dysenteriae, S. flexneri serovar 6 và S. boydii âm tính. e các chủng S. flexneri và S. boydii serovar 13 và 14 sinh axit và sinh khí. f các chủng S. dysenteriae serovar 1 và S. boydii serovar 13 luôn dương tính. g các chủng S. dysenteriae serovar 5 và S. flexneri serovar 6 là dương tính. h các chủng S. dysenteriae serovar 5 và 10 dương tính và 4 và 6 thay đổi khác nhau.  i chỉ có các chủng S. boydii serovar 13 là dương tính.

9.4.3.7. Phát hiện sự hình thành Indol (B.9)

Cấy dịch cấy thuần khiết vào ống chứa 5 ml môi trường tryptophan/trypton (B.9.1).

Ủ trong tủ (6.3) ở 37 ^oC ± 1 ^oC trong 24 h ± 3 h.

Sau khi ủ, thêm 1 ml thuốc thử Kovac (B.9.2).

Sự hình thành vòng màu đỏ trong vòng 10 min cho thấy có sinh indol và màu nâu/vàng chứng tỏ phản ứng âm tính.

Shigella sonnei âm tính trong khi các chủng khác cho các phản ứng khác nhau (xem Bảng 1).

9.4.3.8. Phát hiện β-galactosidaza (B.10)

Hòa một vòng đầy dịch cấy thuần khiết từ thạch dinh dưỡng vào ống nghiệm hoặc chai có chứa 0,25 ml dung dịch muối (B.12), vặn nắp chai hoặc ống nghiệm.

Thêm một giọt toluen và lắc kỹ ống.

Đặt ống này vào tủ ấm (6.7) đặt ở 37 ^oC và để trong vài phút.

Thêm 0,25ml thuốc thử để phát hiện b-galactosidaza và lắc đều.

Đặt lại ống vào tủ ấm (6.7) để ở 37 ºC và để trong 24 h ± 3 h, kiểm tra ống thường xuyên.

Màu vàng chứng tỏ sinh β-galactosidaza, phản ứng thường xuất hiện trong 20 min.

Shigella sonnei dương tính, B. dysenteriae và S. boydii cho các phản ứng khác nhau trong khi S. flexneri âm tính (xem Bảng 1).

9.4.3.9. Sử dụng cacbohydrat (B.11)

Cấy một lượng nhỏ dịch cấy vào canh thang cacbohydrat đã chuẩn bị.

Ủ trong tủ (6.3) ở 37 ^oC ± 1 ^oC trong 24 h ± 3 h.

Phản ứng dương tính cacbohydrat được dùng để đổi màu chất chỉ thị pH từ màu tía sang màu vàng.

Bảng 1 đưa ra các phản ứng của các loài Shigella khác nhau.

9.4.3.10. Diễn giải các kết quả sinh hóa

Các chủng thuộc một số loài Shigella khác nhau ở các phản ứng sinh hóa (xem Bảng 1), do đó việc diễn giải chỉ được dựa vào các kết quả sinh hóa là rất khó và cần phải khẳng định bằng kiểu huyết thanh.

Shigella là các trực khuẩn Gram âm, có kích thước từ 2 µm đến 4 µm ± 0,5 µm, thường là dạng vi khuẩn hình cầu ngắn hơn và điển hình là không sinh khí từ glucoza. Chúng không di động, không sinh khí hydro sulfua hoặc lysin khử nhóm cacboxyl và âm tính lactoza trong 24 h. Các phép thử khác mô tả ở trên cho các phản ứng khác nhau hoặc khác nhau về phản ứng theo các loài.

Trong giống Shigella, mannitol phân biệt Shigella dysenteriae (âm tính) với các loài khác và L-Ornithin decacboxylaza phân biệt Shigella sonnei (dương tính) với các loài khác.

9.4.4. Phân biệt bằng sinh hóa bổ sung

9.4.4.1. Yêu cầu chung

Khuyến cáo thực hiện bổ sung phép thử phân biệt bằng sinh hóa để nhận biết tốt hơn của các chủng: một số chủng Escherichia coli giống các loài của Shigella.

9.4.4.2. Natri axetat

Cấy vạch chủng cấy thuần khiết (9.4.1) vào bề mặt nghiêng của môi trường natri axetat (B.13). Dùng kim cấy thẳng để giảm tối đa môi trường bị chuyển sang cùng với dịch cấy, hoặc dùng một kim cấy.

Ủ trong điều kiện hiếu khí 2 ngày ở 37 ^oC ± 1 ^oC.

Kiểm tra môi trường xanh lá cây về sự phát triển: môi trường chuyển sang màu xanh da trời chứng tỏ phản ứng dương tính.

Kiểm tra sự phát triển, nếu có màu xanh da trời cho thấy phản ứng dương tính.

Nếu không thấy phát triển, thì ủ thêm 2 ngày ở 37 ^oC ± 1 ^oC. Kiểm tra lại môi trường.

Các loài Shigella không phát triển hoặc phát triển rất yếu. Các chủng E. coli cho các khuẩn lạc màu xanh da trời được bao quanh bởi môi trường xanh da trời/xanh lá cây.

9.4.4.3. Christensen xitrat

Dùng kim cấy, cấy dịch cấy thuần khiết (9.4.1) vào bề mặt nghiêng của Christensen xitrat (B.14). Hạn chế tối đa môi trường bị chuyển sang cùng với dịch cấy.

Ủ trong điều kiện hiếu khí 2 ngày ở 37 ^oC ± 1 ^oC.

Kiểm tra để phát hiện sự phát triển màu kem/hồng. Trong trường hợp này, môi trường chuyển sang màu đỏ.

Nếu không thấy phát triển thì ủ thêm 2 ngày và kiểm tra lại môi trường.

Các loài Shigella không phát triển.

9.4.4.4. Natri mucat

Cấy dịch cấy thuần khiết (9.4.1) vào canh thang thử nghiệm (B.15.1) và canh thang kiểm chứng (B.15.2).

Ủ trong điều kiện hiếu khí 2 ngày ở 37 ^oC ± 1 ^oC.

Kiểm tra môi trường về sự phát triển và sự đổi màu. Màu xanh da trời chứng tỏ phản ứng âm tính và màu vàng rơm/vàng chứng tỏ phản ứng dương tính.

Nếu không thấy phát triển, thì ủ thêm 2 ngày ở 37 ^oC ± 1 ^oC. Kiểm tra lại môi trường.

Shigella sonnei cho các phản ứng khác nhau còn các loài Shigella khác là âm tính.

Các chi tiết tiếp theo về phản ứng của các loài Shigella, xem Bảng 2.

Bảng 2 – Các phép thử sinh hóa bổ sung^a để phân biệt một số chủng Shigella spp. và Escherichia coli

Loài	Phản ứng sinh hóa (phát triển) trong một thời gian ủ xác định
	Natri axetat		Christensen xitrat		Natri mucat
	+ % trong 2 ngày	+ % sau 2 ngày	+ % trong 2 ngày	+ % sau 2 ngày	+ % trong 2 ngày	+ % sau 2 ngày
S. dysenteriae	– (0)	– (0)	– (0)	– (0)	– (0)	– (0)
S. flexneri	– (0)	– (0)	– (0)	– (0)	– (0)	– (0)
S. boydii	– (0)	– (0)	– (0)	– (0)	– (0)	– (0)
S. sonnei	– (0)	– (0)	– (0)	– (0)	V (6,4)	V (36,7)
E. coli	V (83,8)	+ (93,5)	V (> 15,3)	V (> 34,2)	+ (91,6)	+ (93,0)
+ > 90 % các chủng dương tính. – > 90 % các chủng âm tính. V các kết quả của các chủng dương tính dao động từ 10 % đến 89 %. % phần trăm các kết quả dương tính xác định được sau khi ủ. a được lấy từ Sổ tay Phân tích Sinh hóa, xuất bản lần thứ 8 (soát xét năm 1997), của FDA, USA.

9.5. Khẳng định bằng huyết thanh

9.5.1. Phân biệt bằng kháng nguyên

Các loài Shigella không di động và do đó không có các kháng nguyên lông. Việc phân biệt trong và giữa các loài phụ thuộc vào phép phân tích kháng nguyên thân nhóm “O” và các kháng nguyên kiểu “O” cụ thể (xem Bảng 3). Việc định kiểu serovar tốt nhất là do Phòng thử nghiệm Chuẩn thực hiện.

Cần đến chủng cấy mới phát triển trên thạch dinh dưỡng (xem 9.4.1). Tiến hành phép thử ngưng kết trên các phiến kính hoặc tấm kính sạch (6.13) có kích thước phù hợp.

Bảng 3 – Phân biệt bằng tính kháng nguyên trong các loài Shigella

Các loài Shigella	Nhóm kháng nguyên	Serovar (chỉ ra kháng nguyên cụ thể)
S. dysenteriae	A	1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13
S. flexneri	B	1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 5a, 5b, 6, X, Y
S. boydii	C	1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18
S. sonnei	D	1

CHÚ THÍCH 1: Các nhóm kháng nguyên (A, B, C, D) có thể chứa các kháng nguyên nhỏ mà có thể phản ứng chéo với các kháng nguyên nhóm khác, điều này tránh được bằng cách sử dụng kháng huyết thanh hấp thụ và/hoặc được pha loãng đến mức qui định. Một số loài, cụ thể là Shigella dysenteriae có các kháng nguyên vỏ mà có thể che nhóm và che các kháng nguyên serovar tránh làm ngưng kết với kiểu kháng huyết thanh cụ thể. Kháng nguyên vỏ được loại ra bằng cách đun nóng huyền phù đến 100 ^oC trong thời gian từ 15 min đến 60 min.

CHÚ THÍCH 2: Các Shigella sonnei nhóm kháng nguyên D có mặt trong cả hai dạng khuẩn lạc trơn nhẵn và thô ráp và không có phản ứng chéo với các nhóm kháng nguyên Shigella khác. Không giống như các Enterobacteriae khác, các dạng khuẩn lạc thô của S. sonnei không tự ngưng kết. Shigella sonnei không có kháng nguyên vỏ.

9.5.2. Phép thử ngưng kết

Thực hiện chính xác hướng dẫn của nhà sản xuất về chuẩn bị kháng huyết thanh và các phép thử ngưng kết.

Cho một giọt kháng huyết thanh nhóm và một giọt dung dịch muối (B.12) riêng rẽ trên phiến kính (6.13). Phân tán đều một phần khuẩn lạc cần thử trong giọt nước muối và một phần khuẩn lạc trong giọt dung dịch kháng huyết thanh sao cho để thu được huyền phù đồng nhất và đục trong mỗi giọt.

Lắc nhẹ phiến kính 30 s đến 60 s.

Quan sát kết quả trên nền đen, sử dụng kính lúp, nếu cần.

Nếu khuẩn lạc trong giọt kháng huyết thanh kết thành mảng gồm ít hoặc nhiều các hạt khác biệt và không có ngưng kết trong giọt nước muối, thì khuẩn lạc phân lập là dương tính đối với nhóm thử nghiệm. Nếu ngưng kết trong nước muối, thì chủng này được coi là tự ngưng kết và không được sử dụng tiếp. Cần kiểm tra các khuẩn lạc khác từ cùng một chủng cấy và các khuẩn lạc phân lập khác từ môi trường thạch chọn lọc ban đầu được lấy để kiểm tra và có các phản ứng hóa sinh cho thấy có mặt Shigella. Nếu tất cả các khuẩn lạc tự ngưng kết, thì cần được Phòng thử nghiệm chuẩn tư vấn để nhận biết khuẩn lạc phân lập.

Nếu tất cả các phép thử là âm tính và các phép thử sinh hóa cho thấy các đặc trưng của Shigella thì đun nóng huyền phù của các chủng thuần khiết trên nồi cách thủy ở 100 ^oC trong 60 min và lặp lại các phép thử ngưng kết

9.5.3. Khẳng định cuối cùng

Để khẳng định và/hoặc phân tích ngoài yếu tố “nhóm” (xem Bảng 3), thì các khuẩn lạc phân lập phải được gửi đến Phòng thử nghiệm Chuẩn đã được công nhận để khẳng định typ.

Khi gửi đi để định dạng phải kèm theo tất cả thông tin liên quan đến các khuẩn lạc phân lập đó.

10. Biểu thị kết quả

Theo diễn giải các kết quả, báo cáo có mặt hay không có mặt các loài Shigella trong x g hoặc x ml phần mẫu thử.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:

1. a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
2. b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
3. c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
4. d) mọi chi tiết thao tác khác với quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.
5. e) kết quả thử nghiệm thu được.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Lưu đồ quy trình thử nghiệm

 

Phụ lục B

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thuốc thử

B.1 Canh thang tăng sinh chọn lọc

B.1.1 Canh thang Shigella

B.1.1.1 Thành phần

Dịch thủy phân casein bằng enzym Kalihydrophosphat (khan) Kali dihydrophosphat (khan) Natri clorua D (+)-Glucoza Polyoxyetylensorbitan monooleat (Tween 80) Nước

20,0 g 2,0 g 2,0 g 5,0 g 1,0 g 1,5 ml 1 000 ml

B.1.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần (hoặc môi trường hoàn chỉnh khô) trong nước bằng cách đun nóng nhẹ, nếu cần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 ^oC, dùng máy đo pH (6.8), nếu cần.

Phân phối từng lượng 225 ml môi trường vào các bình hoặc chai (6.9) có dung tích thích hợp, hoặc vật chứa lớn hơn nếu phân tích ngay.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC.

Nếu môi trường chưa sử dụng ngay, thì bảo quản ở 5 ^oC ± 3 ^oC, loại bỏ sau 1 tháng nếu chưa sử dụng.

B.1.2 Dung dịch Novobioxin

B.1.2.1 Thành phần

Novobioxin Nước cất

25,0 mg 1 000 ml

B.1.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan Novobioxin trong nước.

Lọc để khử trùng qua màng lọc 0,2 µm [xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

Bảo quản dung dịch ở 5 ^oC ± 3 ^oC và loại bỏ dung dịch chưa sử dụng trong vòng 1 tháng.

B.1.3 Môi trường hoàn chỉnh

Ngay khi sử dụng, cho thêm 5 ml dung dịch novobioxin (B.1.2) vào từng 225 ml canh thang Shigella (B.1.1) hoặc 22 ml dung dịch novobioxin trên một lít canh thang Shigella nếu chuẩn bị các thể tích lớn hơn. Trộn kỹ.

Môi trường này có nồng độ novobioxin cuối cùng là 0,5 µg/ml canh thang sau khi được bổ sung 25 g hoặc 25 ml mẫu thử.

B.2 Các môi trường thạch phân biệt chọn lọc

B.2.1 Thạch MacConkey

Dịch thủy phân casein và mô động vật bằng enzym Lactoza Muối mật Số 3 Natri clorua Đỏ trung tính Tím tinh thể Thạch Nước	20,0 g 10,0 g 1,5 g 5,0 g 0,03 g 0,001 g 9 g đến 18 ga 1 000 ml
a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

B.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần cơ bản hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng trong một thời gian vừa đủ để hòa tan các thành phần.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,1 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Khử trùng 15 min ở nhiệt độ 121 ^oC trong nồi hấp áp lực (6.1), hoặc theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Làm nguội môi trường tan chảy trên nồi cách thủy (6.5) để ở 47 ^oC.

Rót môi trường này với các lượng 15 ml vào các đĩa Petri và để cho đông đặc lại trên mặt phẳng mát, nằm ngang.

Ngay trước khi sử dụng, làm khô các đĩa thạch một cách cẩn thận, tháo bỏ nắp ra và úp bề mặt thạch xuống cho vào tủ sấy (6.2) để ở nhiệt độ từ 37 ^oC đến 55 ^oC cho đến khi bề mặt thạch khô hoặc để trong buồng sấy để bề mặt thạch hướng lên trên.

Nếu các đĩa thạch đã chuẩn bị trước, thì các đĩa chưa khô có thể được gói vào trong các túi chất dẻo (hoặc tương tự) để tránh bị khô và bảo quản ở 5 ^oC ± 3 ^oC. Loại bỏ các đĩa chưa sử dụng trong vòng 2 tuần.

B.2.2 Thạch deoxycolat lysin xyloza (thạch XLD)

CHÚ THÍCH: Các công thức môi trường bán sẵn thay đổi tùy thuộc vào môi trường đã được hấp áp lực ở 121 ^oC hay chỉ được đun sôi.

B.2.2.1 Thành phần

Chất chiết nấm men L-lysin HCl Xyloza Lactoza Sacaroza Natri clorua Natri deoxycholat Natri thiosulfat Sắt (III) amoni xitrat Đỏ phenol Thạch Nước	3,0 g 5,0 g 3,75 g 7,5 g 7,5 g 5,0 g 1,0 g 6,8 g 0,8 g 0,08 g 9 g đến 18 g a 1 000 ml
a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

B.2.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc thành phần hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi trong thời gian ngắn cho đến khi hòa tan.

Chỉnh pH (6.8) sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Làm nguội môi trường tan chảy trên nồi cách thủy (6.5) để ở 47 ^oC.

Rót môi trường này với các lượng 15 ml vào các đĩa Petri và để cho đông đặc lại trên mặt phẳng mát, nằm ngang.

Ngay trước khi sử dụng, làm khô các đĩa thạch một cách cẩn thận, tháo bỏ nắp ra và úp bề mặt thạch xuống cho vào tủ sấy (6.2) để ở nhiệt độ từ 37 ^oC đến 55 ^oC cho đến khi bề mặt thạch khô hoặc để trong buồng sấy để bề mặt thạch hướng lên trên.

Nếu các đĩa thạch đã chuẩn bị trước, thì các đĩa chưa khô có thể được gói vào trong các túi chất dẻo (hoặc tương tự) để tránh bị khô và bảo quản ở 5 ^oC ± 3 ^oC. Loại bỏ các đĩa chưa sử dụng trong vòng 2 tuần.

B.2.3 Thạch Hektoen (HE)

B.2.3.1 Thành phần

Sản phẩm thủy phân thịt bằng enzym Chất chiết nấm men Lactoza Sacaroza Salixin Muối mật Số 3 Natri clorua Natri thiosulfat Sắt (III) amoni xitrat Axit fucxin Xanh bromothymol Thạch Nước	12,0 g 3,0 g 12,0 g 12,0 g 2,0 g 9,0 g 5,0 g 5,0 g 1,5 g 0,1 g 0,065 g 12 g đến 18 g a 1 000 ml
a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

B.2.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc thành phần hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi trong thời gian ngắn cho đến khi hòa tan thạch hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Chỉnh pH (6.8) sao cho sau khi khử trùng là 7,5 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Làm nguội môi trường tan chảy trên nồi cách thủy (6.5) để ở 47 ^oC.

Rót môi trường này với các lượng 15 ml vào các đĩa Petri và để cho động đặc lại trên mặt phẳng mát, nằm ngang.

Ngay trước khi sử dụng, làm khô các đĩa thạch một cách cẩn thận, tháo bỏ nắp ra và úp bề mặt thạch xuống cho vào tủ sấy (6.2) để ở nhiệt độ từ 37 ^oC đến 55 ^oC cho đến khi bề mặt thạch khô hoặc để trong buồng sấy để bề mặt thạch hướng lên trên.

Nếu các đĩa thạch đã chuẩn bị trước, thì các đĩa chưa khô có thể được gói vào trong các túi chất dẻo (hoặc tương tự) để tránh bị khô và bảo quản ở 5 ^oC ± 3 ^oC. Loại bỏ các đĩa chưa sử dụng trong vòng 2 tuần.

B.3 Thạch dinh dưỡng

B.3.1 Thành phần

Chất chiết thịt Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym Thạch Nước	3,0 g 5,0 g 12 g đến 18 g a 1 000 ml
a Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

B.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH (6.8) sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Chuyển môi trường cấy vào trong các bình hoặc chai có dung tích thích hợp.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC.

B.3.3 Chuẩn bị các đĩa thạch dinh dưỡng

Chuyển khoảng 15 ml môi trường tan chảy, đã được làm nguội đến 47 ^oC vào các đĩa Petri.

Ngay trước khi sử dụng, làm khô các đĩa thạch một cách cẩn thận, tháo bỏ nắp ra và úp bề mặt thạch xuống cho vào tủ sấy (6.2) để ở nhiệt độ từ 37 ^oC đến 55 ^oC cho đến khi bề mặt thạch khô hoặc để trong buồng sấy để bề mặt thạch hướng lên trên.

Nếu các đĩa thạch đã chuẩn bị trước, thì các đĩa chưa khô có thể được gói vào trong các túi chất dẻo (hoặc tương tự) để tránh bị khô và bảo quản ở 5 ^oC ± 3 ^oC. Loại bỏ các đĩa chưa sử dụng trong vòng 2 tuần.

B.4 Thạch TSI Thạch sắt ba đường

B.4.1 Thành phần

Chất chiết thịt Chất chiết nấm men Pepton Natri clorua Lactoza Sacaroza Glucoza Sắt (III) xitrat Natri thiosulfat Đỏ phenol Thạch Nước	3,0 g 3,0 g 20,0 g 5,0 g 10,0 g 10,0 g 1,0 g 0,3 g 0,3 g 0,024 g 9 g đến 18 g a 1 000 ml
a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

B.4.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH (6.8) sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối môi trường các lượng 10 ml vào các ống nghiệm hoặc các đĩa (6.11) có dung tích thích hợp.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC.

Đặt nghiêng để thạch có bề dày từ 2,5 cm đến 5 cm.

Nếu chưa sử dụng thì bảo quản ở 5 ^o C ± 3 ^oC. Loại bỏ trong vòng 1 tháng nếu chưa sử dụng.

B.5 Thạch dinh dưỡng nửa đặc

B.5.1 Thành phần

Chất chiết thịt Sản phẩm thủy phân mô động vật bằng enzym Thạch Nước	3,0 g 5,0 g 4 g đến 9 g a 1 000 ml
a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

B.5.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun nóng.

Chỉnh pH (6.8) sao cho sau khi khử trùng là 7,5 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Chuyển 10 ml môi trường tan chảy vào các ống hoặc chai có nắp vặn (6.11) có dung tích thích hợp.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC.

Nếu chưa sử dụng thì bảo quản ở 5 ^oC ± 3 ^oC. Loại bỏ trong vòng 1 tháng nếu chưa sử dụng.

B.6 Thạch ure (môi trường Christensen)

B.6.1 Môi trường cơ bản

B.6.1.1 Thành phần

Sản phẩm thủy phân mô động vật bằng enzym Glucoza Natri clorua Kali dihydro phosphat (KH2PO4) Đỏ phenol Thạch Nước	1,0 g 1,0 g 5,0 g 2,0 g 0,012 g 9 g đến 18 ga 1 000 ml
a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

B.6.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH (6.8) sao cho sau khi khử trùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC.

B.6.2 Dung dịch ure

B.6.2.1 Thành phần

Ure Nước vừa đủ

400 g 1 000 ml

B.6.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan ure trong nước. Lọc để khử trùng và kiểm tra độ vô trùng.

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

B.6.3 Môi trường hoàn chỉnh

B.6.3.1 Thành phần

Môi trường cơ bản (B.6.1) Dung dịch ure (B.6.2)

900 ml 50 ml

B.6.2.3 Chuẩn bị

Trong điều kiện vô trùng, cho dung dịch ure vào môi trường cơ bản, đã làm tan chảy trước và sau đó để nguội đến nhiệt độ 47 ^oC (6.5).

Phân phối các lượng 10 ml môi trường hoàn chỉnh vào trong các ống hoặc đĩa (6.11) có kích thước phù hợp.

Đặt nghiêng ống nghiệm.

B.7 Môi trường L-lysin đã khử nhóm carboxyl

B.7.1 Thành phần

L-lysin monohydroclorua Chất chiết nấm men Glucoza Bromocresol đỏ tía Nước

5,0 g 3,0 g 1,0 g 0,015 g 1 000 ml

B.7.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH (6.8) sao cho sau khi khử trùng là 6,8 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Chuyển các lượng môi trường từ 2 ml đến 5 ml vào các ống cấy hẹp (6.11) có nắp vặn.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC.

B.8 Môi trường L-Ornithin đã khử nhóm carboxyl

Tiến hành theo B.7, nhưng thay 5,0 g L-lysin monohydroclorua bằng 0,5 g L-Ornithin monohydroclorua.

B.9 Thuốc thử cho phản ứng indol

B.9.1 Môi trường trypton/DL-tryptophan

B.9.1.1 Thành phần

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym của tuyến tụy Natri clorua DL-Tryptophan Nước

10,0 g 5,0 g 1,0 g 1 000 ml

B.9.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun sôi.

Chỉnh pH (6.8) sao cho sau khi khử trùng là 7,5 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối các lượng 5 ml môi trường vào các ống cấy hẹp hoặc chai có nắp vặn (6.11).

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC.

Nếu chưa sử dụng thì bảo quản ở 5 ^oC ± 3 ^oC. Loại bỏ trong vòng 1 tháng nếu chưa sử dụng.

B.9.2 Thuốc thử Kovacs cho phản ứng indol

B.9.2.1 Thành phần

4-Dimetylaminobenzaldehyt Axit clohydric, (ρ = 1,18 g/ml đến 1,19 g/ml) 2-Metylbutan-2-ol

5,0 g 25 ml 75 ml

B.9.2.2 Chuẩn bị

Trộn đều các thành phần trên.

Bảo quản ở 5 ^oC ± 3 ^oC và sử dụng trong 1 tháng.

B.10 Thuốc thử β-galactosidaza

B.10.1 Dung dịch đệm

B.10.1.1 Thành phần

Natri dihydro phosphat (NaH2PO4) Natri hydroxit, dung dịch 10 mol/l Nước vừa đủ

6,9 g khoảng 3 ml 50 ml

B.10.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan natri dihydro phosphat trong khoảng 45 ml nước đựng trong bình định mức 50 ml.

Chỉnh pH (6.8) đến 7,0 ± 0,2 ở 25 ^oC, bằng dung dịch natri hydroxit.

Thêm nước vừa đủ 50 ml.

B.10.2 Dung dịch ONPG

B.10.2.1 Thành phần

o-Nitrophenyl β-D-galactopyransosit (ONPG) Nước

0,08 g 15 ml

B.10.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan ONPG trong nước ở khoảng 50 ^oC (6.5) rồi làm nguội dung dịch.

B.10.3 Thuốc thử hoàn chỉnh

B.10.3.1 Thành phần

Dung dịch đệm (B.10.1) Dung dịch ONPG (B.10.2)

5 ml 15 ml

B.10.3.2 Chuẩn bị

Cho dung dịch đệm vào dung dịch ONPG.

Bảo quản ở 5 ^oC ± 3 ^oC và sử dụng trong 1 tháng.

B.11 Canh thang đỏ tía Bromocresol

B.11.1 Thành phần

Sản phẩm thủy phân mô động vật bằng enzym Chất chiết thịt Natri clorua Cacbohydrat hoặc alcol a Đỏ tía bromocresol Nước	10,0 g 3,0 g 5,0 g 10,0 g 0,04 g 1 000 ml
a Các loại cacbohydrat và cồn sau đây được dùng riêng rẽ: dulcitol, glucoza, lactoza, mannitol, melibioza, raffinoza, salicin, sorbitol, sacaroza, xyloza.

B.11.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH (6.8) sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Lọc để khử trùng qua màng lọc 0,2 µm vào hộp chứa vô trùng.

Phân phối các lượng 5 ml môi trường vào các ống hoặc chai vô trùng (6.11) có kích thước phù hợp.

Kiểm tra vài ống nghiệm đựng từng môi trường hoàn chỉnh về độ vô trùng bằng cách ủ ở 37 ^oC trong 24 h.

Canh thang có thể bền được đến 4 tuần khi bảo quản ở 5 ^oC ± 3 ^oC.

B.12 Dung dịch nước muối

B.12.1 Thành phần

Natri clorua Nước

8,5 g 1 000 ml

B.12.2 Chuẩn bị

Hòa tan natri clorua trong nước.

Chỉnh pH (6.8) sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối các lượng 10 ml dung dịch vào các bình hoặc chai có nắp vặn.

Khử trùng trong 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC.

B.13 Thạch natri axetat

B.13.1 Thành phần

Natri axetat Natri clorua Magie sulfat (khan) Amoni phosphat Kali dihydro phosphat (K2HPO4) Xanh bromothymol Thạch Nước	2,0 g 5,0 g 0,2 g 1,0 g 1,0 g 0,08 g 9 g đến 18 g a 1 000 ml
a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

B.13.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước, trừ magie sulfat, đun nóng và trộn, sau đó thêm magie sulfat hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất môi trường hoàn chỉnh khô.

Chỉnh pH (6.8) sao cho sau khi khử trùng là 6,7 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối các lượng khoảng 8 ml môi trường vào các ống nghiệm (6.11).

Khử trùng trong 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC.

Đặt nghiêng để thạch có bề mặt nghiêng 5 cm.

B.14 Thạch Christensen xitrat

B.14.1 Thành phần

Natri xitrat Glucoza Chất chiết nấm men Xystein mono hydro clorua Sắt amoni xitrat Kali dihydro phosphat (K2HPO4) Natri clorua Natri thiosulfat Đỏ phenol Thạch Nước	3,0 g 0,2 g 0,5 g 0,1 g 0,4 g 1,0 g 5,0 g 0,08 g 0,012 g 9 g đến 18 g a 1 000 ml
a Tùy thuộc vào sức đông của thạch

B.14.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, đun nóng nếu cần.

Chỉnh pH (6.8) sao cho sau khi khử trùng là 6,9 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối môi trường này vào các ống nghiệm (6.11) đến một phần ba ống, đậy nắp.

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC.

Đặt nghiêng để thạch có bề mặt nghiêng 4 cm đến 5 cm và có lớp thạch dày từ 2 cm đến 3 cm.

B.15 Canh thang mucat

B.15.1 Canh thang thử nghiệm

B.15.1.1 Thành phần

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzyma Axit mucic Xanh bromothymol Nước	10,0 g 10,0 g 0,024 g 1 000 ml
a Cách khác, có thể sử dụng 25,0 g canh thang dinh dưỡng số 2.

B.15.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan axit mucic bằng cách thêm các lượng nhỏ dung dịch natri hydroxit 5 mol/l, rồi trộn.

Hòa tan sản phẩm thủy phân casein bằng enzym trong nước, sau đó thêm axit mucic.

Chỉnh pH (6.8) sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối các lượng 5 ml môi trường này vào các ống nghiệm (6.11).

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC.

B.15.2 Canh thang kiểm chứng

B.15.2.1 Thành phần

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym Xanh bromothymol Nước

10,0 g 0,024 g 1 000 ml

B.15.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước cất.

Chỉnh pH (6.8) sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25 ^oC, nếu cần.

Phân phối các lượng 5 ml môi trường này vào các ống nghiệm (6.11).

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 ^oC.

B.16 Các loài Shigella kháng huyết thanh

Cần đến các kháng huyết thanh nhóm (kiểu A, B, C và D, xem Bảng 3). Các loại này sẵn có ở Phòng thử nghiệm chuẩn hoặc có bán sẵn.

Thực hiện theo các hướng dẫn của nhà cung cấp liên quan đến việc chuẩn bị và sử dụng.

 

Phụ lục C

(Quy định)

Mô tả hình thái và màu sắc khuẩn lạc Shigella trên thạch chọn lọc, về mục đích nhận biết và kiểm soát chất lượng

Tất cả các Enterobacteriae trên tất cả các môi trường này có các khuẩn lạc tròn có bề mặt trơn nhẵn và viền mép liền. Kích thước các khuẩn lạc phân lập tốt thường > 2 mm. Xem chi tiết ở Bảng C.1.

Bảng C.1 – Mô tả hình thái khuẩn lạc Shigella và màu sắc trên thạch chọn lọc

Các loài vi khuẩn	Thạch chọn lọc
	Thạch MacConkey	Thạch XLD	Thạch Hektoen
Shigella sonneia	Không màu đến hồng nhạt, trong mờ, lactoza âm tính	Trong mờ, có tâm màu đỏ/đỏ hồng, màu giống thạch	Màu xanh và các khuẩn lạc tăng ẩm ướt
Shigella, các loài khác	Không màu, trong mờ, lactoza âm tính	Trong mờ, có tâm màu đỏ/đỏ hồng, màu giống thạch	Màu xanh và ẩm ướt
Escherichia coli	Màu đỏ, có kết tủa đục trong thạch	Màu vàng, mờ đục bao quanh kết tủa vàng trong thạch	Màu đỏ/hồng da cam có vùng kết tủa trong thạch
Enterobacter cloacae	Màu đỏ, có kết tủa đục trong thạch	Màu vàng, mờ đục bao quanh kết tủa vàng trong thạch	Màu đỏ/hồng da cam có vùng kết tủa trong thạch
Kiebseilla pneumoniae	Màu đỏ, có kết tủa đục trong thạch	Màu vàng, mờ đục và vi khuẩn nhầy bao quanh kết tủa vàng	Màu đỏ/hồng da cam có vùng kết tủa trong thạch
Salmonella	Không màu và trong mờ, thạch xung quanh khuẩn lạc có màu vàng	Màu đỏ có tâm đen	Xanh lục lam, có hoặc không có tâm đen
Proteus mirabills	Không màu và trong mờ, thạch xung quanh khuẩn lạc có màu vàng	Màu vàng, tâm đen, thạch màu vàng có kết tủa	Xanh lục lam, có hoặc không có tâm đen
Enterococcus faecalis	Màu đỏ, các khuẩn lạc tròn nhỏ	Không có hoặc phát triển yếu, khuẩn lạc màu vàng nhạt	Không có hoặc phát triển yếu, khuẩn lạc màu vàng nhạt
a Shigella sonnei có thể lên men lactoza sau khi ủ 40 h, tạo phản ứng nhẹ tương tự như Escherichia coli. Các khuẩn lạc Shigella sonnei có thể cho thấy biến đổi từ trơn nhẵn đến thô, điều này thường kèm theo thất thoát 120 megadalton plasmid và thất thoát virut và các khuẩn lạc có thể tự ngưng kết trên huyền phù trong muối và trong kháng huyết thanh.

 

[1] Theo Ewing W.H. và Lindberg A.A. Serology of the Shigella. Trong: Methods in Microbiology (Ed. Bergan T.), Vol. 14, Acacdemic Press, 1984.