• ISO 7932: 2004/Amd 1: 2020: Định lượng Bacillus cereus giả định Kỹ thuật cấy trải /Enumeration of presumptive Bacillus cereus Spread plate technique
• ISO 7932: 2004/Amd 1: 2020: Định lượng Bacillus cereus giả định Kỹ thuật cấy trải /Enumeration of presumptive Bacillus cereus Spread plate technique

• Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar (MYP)
• Blood Agar (BA)
• Tryptic Soy Broth (TSB)
• Buffered Peptone Water (BPW)
• Nutrient Agar (NA)

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM BACILLUS CEREUS

(Theo tiêu chuẩn ISO 7932:2004 & TCVN 4992:2005)

1. Giới thiệu về Bacillus cereus

Bacillus cereus là vi khuẩn gram dương, hình que, có khả năng tạo bào tử và tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt. Đây là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm qua hai cơ chế chính:

• Ngộ độc tiêu chảy: Do độc tố enterotoxin
• Ngộ độc nôn mửa (emetic syndrome): Do độc tố cereulide

Vi khuẩn này thường xuất hiện trong thực phẩm như cơm, sữa, thịt, hải sản và rau củ.

2. Tiêu chuẩn áp dụng

• ISO 7932:2004 – Phương pháp định lượng Bacillus cereus
• ISO 21871:2006 – Phát hiện và định lượng Bacillus cereus sinh độc tố
• TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004) – Phương pháp phát hiện Bacillus cereus trong thực phẩm
• QCVN 8-3:2012/BYT – Giới hạn vi sinh vật trong thực phẩm

3. Nguyên tắc phương pháp

Có hai phương pháp chính để kiểm nghiệm Bacillus cereus:

1. Phương pháp đếm khuẩn lạc (Plate Count Method – ISO 7932)
2. Phương pháp MPN (Most Probable Number) – ISO 21871

Phương pháp đếm khuẩn lạc được sử dụng phổ biến hơn trong kiểm tra vi sinh thực phẩm.

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

• Tủ ấm vi sinh (30 – 37°C ± 1°C) – Theo ISO 7218
• Tủ an toàn sinh học cấp II – Nếu làm việc với mẫu có nguy cơ cao
• Máy vortex, máy lắc, máy đếm khuẩn lạc (nếu có)
• Pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy

4.2. Môi trường nuôi cấy

• Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar (MYP) – Môi trường chọn lọc đặc trưng
• Blood Agar (BA) – Kiểm tra β-hemolysis
• Tryptic Soy Broth (TSB) – Môi trường tăng sinh
• Buffered Peptone Water (BPW) – Dung dịch pha loãng
• Nutrient Agar (NA) – Môi trường nuôi cấy không chọn lọc

5. Quy trình thực hiện

5.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc (ISO 7932)

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

1. Cân 25g thực phẩm, hòa vào 225mL dung dịch BPW
2. Lắc đều và để ổn định trong 10 phút
3. Tiến hành pha loãng thập phân liên tiếp (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³…)

Bước 2: Cấy mẫu lên môi trường chọn lọc

• Chọn 2 – 3 mức pha loãng phù hợp
• Dùng phương pháp dàn đều (Spread Plate Method):
  • Lấy 0,1mL mẫu pha loãng, nhỏ lên bề mặt môi trường MYP
  • Dùng que gạt vô trùng trải đều mẫu

Bước 3: Ủ mẫu

• Ủ đĩa ở 30°C trong 24 ± 2 giờ

Bước 4: Đếm khuẩn lạc

• Khuẩn lạc Bacillus cereus trên MYP Agar có đặc điểm:
  • Khuẩn lạc màu hồng nhạt đến đỏ
  • Vùng kết tủa màu trắng xung quanh khuẩn lạc (do lecithinase dương tính)
• Chọn các đĩa có 30 – 300 khuẩn lạc để đếm

Bước 5: Xác nhận sinh hóa

• Kiểm tra Oxidase (-) & Catalase (+)
• β-Hemolysis trên Blood Agar (+)
• Khả năng lên men glucose (+)
• Test di động (Motility Test) (+)

Bước 6: Tính kết quả

N=∑C(n1+0,1n2)×dN = \frac{\sum C}{(n_1 + 0,1 n_2) \times d}

Trong đó:

• ∑C\sum C = Tổng số khuẩn lạc đếm được
• n1n_1 = Số đĩa ở độ pha loãng thấp hơn
• n2n_2 = Số đĩa ở độ pha loãng cao hơn
• dd = Hệ số pha loãng của độ pha loãng thấp hơn

5.2. Phương pháp MPN (ISO 21871) – Định lượng vi khuẩn có mật độ thấp

1. Chuẩn bị 3 dãy ống nghiệm chứa môi trường TSB
2. Cấy 10mL, 1mL, và 0.1mL mẫu vào các dãy ống tương ứng
3. Ủ ở 30°C trong 24 giờ
4. Cấy ống dương tính lên môi trường MYP
5. Đếm số ống dương tính và tra bảng MPN để tính kết quả