Chỉ tiêu	Nền mẫu	Giới hạn định lượng/ phạm vi đo	Kỹ thuật/ Phương pháp phân tích
Định lượng Bacillus cereus giả định Kỹ thuật cấy trải /Enumeration of presumptive Bacillus cereus Spread plate technique	Thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản(3) Animal feed and aqua feed	10 CFU/g 1 CFU/mL	ISO 7932: 2004/Amd 1: 2020
Định lượng Bacillus cereus giả định Kỹ thuật cấy trải /Enumeration of presumptive Bacillus cereus Spread plate technique	Thực phẩm(3),(4) Food	10 CFU/g 1 CFU/mL	ISO 7932: 2004/Amd 1: 2020

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM BACILLUS CEREUS

(Theo tiêu chuẩn ISO 7932:2004 & TCVN 4992:2005)

1. Giới thiệu về Bacillus cereus

Bacillus cereus là vi khuẩn gram dương, hình que, có khả năng tạo bào tử và tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt. Đây là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm qua hai cơ chế chính:

Ngộ độc tiêu chảy: Do độc tố enterotoxin
Ngộ độc nôn mửa (emetic syndrome): Do độc tố cereulide

Vi khuẩn này thường xuất hiện trong thực phẩm như cơm, sữa, thịt, hải sản và rau củ.

2. Tiêu chuẩn áp dụng

ISO 7932:2004 – Phương pháp định lượng Bacillus cereus
ISO 21871:2006 – Phát hiện và định lượng Bacillus cereus sinh độc tố
TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004) – Phương pháp phát hiện Bacillus cereus trong thực phẩm
QCVN 8-3:2012/BYT – Giới hạn vi sinh vật trong thực phẩm

3. Nguyên tắc phương pháp

Có hai phương pháp chính để kiểm nghiệm Bacillus cereus:

Phương pháp đếm khuẩn lạc (Plate Count Method – ISO 7932)
Phương pháp MPN (Most Probable Number) – ISO 21871

Phương pháp đếm khuẩn lạc được sử dụng phổ biến hơn trong kiểm tra vi sinh thực phẩm.

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

Tủ ấm vi sinh (30 – 37°C ± 1°C) – Theo ISO 7218
Tủ an toàn sinh học cấp II – Nếu làm việc với mẫu có nguy cơ cao
Máy vortex, máy lắc, máy đếm khuẩn lạc (nếu có)
Pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy

4.2. Môi trường nuôi cấy

Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar (MYP) – Môi trường chọn lọc đặc trưng
Blood Agar (BA) – Kiểm tra β-hemolysis
Tryptic Soy Broth (TSB) – Môi trường tăng sinh
Buffered Peptone Water (BPW) – Dung dịch pha loãng
Nutrient Agar (NA) – Môi trường nuôi cấy không chọn lọc

5. Quy trình thực hiện

5.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc (ISO 7932)

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

Cân 25g thực phẩm, hòa vào 225mL dung dịch BPW
Lắc đều và để ổn định trong 10 phút
Tiến hành pha loãng thập phân liên tiếp (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³…)

Bước 2: Cấy mẫu lên môi trường chọn lọc

Chọn 2 – 3 mức pha loãng phù hợp
Dùng phương pháp dàn đều (Spread Plate Method):
- Lấy 0,1mL mẫu pha loãng, nhỏ lên bề mặt môi trường MYP
- Dùng que gạt vô trùng trải đều mẫu

Bước 3: Ủ mẫu

Ủ đĩa ở 30°C trong 24 ± 2 giờ

Bước 4: Đếm khuẩn lạc

Khuẩn lạc Bacillus cereus trên MYP Agar có đặc điểm:
- Khuẩn lạc màu hồng nhạt đến đỏ
- Vùng kết tủa màu trắng xung quanh khuẩn lạc (do lecithinase dương tính)
Chọn các đĩa có 30 – 300 khuẩn lạc để đếm

Bước 5: Xác nhận sinh hóa

Kiểm tra Oxidase (-) & Catalase (+)
β-Hemolysis trên Blood Agar (+)
Khả năng lên men glucose (+)
Test di động (Motility Test) (+)

Bước 6: Tính kết quả

$N=∑C(n1+0,1n2)×dN = \frac{\sum C}{(n_1 + 0,1 n_2) \times d}$

Trong đó:

$∑C\sum C$ = Tổng số khuẩn lạc đếm được
$n1n_1$ = Số đĩa ở độ pha loãng thấp hơn
$n2n_2$ = Số đĩa ở độ pha loãng cao hơn
$dd$ = Hệ số pha loãng của độ pha loãng thấp hơn

5.2. Phương pháp MPN (ISO 21871) – Định lượng vi khuẩn có mật độ thấp

Chuẩn bị 3 dãy ống nghiệm chứa môi trường TSB
Cấy 10mL, 1mL, và 0.1mL mẫu vào các dãy ống tương ứng
Ủ ở 30°C trong 24 giờ
Cấy ống dương tính lên môi trường MYP
Đếm số ống dương tính và tra bảng MPN để tính kết quả

6. Đánh giá kết quả theo tiêu chuẩn

Sản phẩm	Tiêu chuẩn	*Giới hạn Bacillus cereus* (CFU/g hoặc CFU/mL)**
Sữa bột, sữa tiệt trùng	QCVN 8-3:2012/BYT	< 10³ CFU/g
Gạo, bột mì	ISO 7932:2004	< 10⁴ CFU/g
Hải sản tươi sống	TCVN 4992:2005	< 10³ CFU/g
Thực phẩm chế biến sẵn	QCVN 8-3:2012/BYT	Không có (0 CFU/g)

7. Ứng dụng

Kiểm tra an toàn thực phẩm
Đánh giá chất lượng thực phẩm chế biến sẵn
Giám sát vệ sinh trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm