• PHE ID8/ISSUE No. 4.1: 2016: Phát hiện Clostridium spp. /Detection of Clostridium spp.
• ISO 14189: 2013: Định lượng Clostridium perfringens Phương pháp lọc qua màng /Enumeration of Clostridium perfringens Membrane filtration method
• AOAC 977.26: Phát hiện Clostridium botulinum /Detection of Clostridium botulinum
• ISO 15213-2: 2024: Định lượng Clostridium perfringens Kỹ thuât đếm khuẩn lạc /Enumeration of Clostridium perfringens Colony count technique
• SO 15213-2: 2023: Định lượng Clostridium perfringens Kỹ thuât đếm khuẩn lạc /Enumeration of Clostridium perfringens Colony count technique

• Tryptose Sulfite Cycloserine Agar (TSC Agar)
• Sulfite Polymyxin Sulfadiazine (SPS Agar)
• Fluid Thioglycolate Medium (FTM)
• Buffered Peptone Water (BPW)
• Blood Agar (BA)

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

(Theo tiêu chuẩn ISO 7937:2004 & TCVN 4991:2005)

1. Giới thiệu về Clostridium perfringens

Clostridium perfringens là vi khuẩn Gram dương, kỵ khí, hình que, có khả năng tạo bào tử. Đây là một tác nhân chính gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt trong các thực phẩm chế biến sẵn, thịt, gia cầm, sản phẩm từ sữa và thực phẩm đóng hộp.

Vi khuẩn này gây bệnh thông qua việc sản xuất độc tố trong ruột non, với các triệu chứng như tiêu chảy, đau bụng và nôn mửa.

2. Tiêu chuẩn áp dụng

• ISO 7937:2004 – Phương pháp định lượng Clostridium perfringens
• TCVN 4991:2005 – Phương pháp phát hiện Clostridium perfringens trong thực phẩm
• QCVN 8-3:2012/BYT – Giới hạn vi sinh vật trong thực phẩm

3. Nguyên tắc phương pháp

Có hai phương pháp chính để kiểm nghiệm Clostridium perfringens:

1. Phương pháp đếm khuẩn lạc (ISO 7937)
2. Phương pháp MPN (Most Probable Number) – Định lượng vi khuẩn có mật độ thấp

Phương pháp đếm khuẩn lạc được sử dụng phổ biến hơn trong kiểm tra vi sinh thực phẩm.

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

• Tủ ấm kỵ khí (37°C ± 1°C, có điều kiện kỵ khí)
• Tủ an toàn sinh học cấp II
• Máy đếm khuẩn lạc, pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy

4.2. Môi trường nuôi cấy

• Tryptose Sulfite Cycloserine Agar (TSC Agar) – Môi trường chọn lọc đặc trưng
• Sulfite Polymyxin Sulfadiazine (SPS Agar) – Môi trường chọn lọc khác
• Fluid Thioglycolate Medium (FTM) – Môi trường tăng sinh
• Buffered Peptone Water (BPW) – Dung dịch pha loãng
• Blood Agar (BA) – Kiểm tra hemolysis

5. Quy trình thực hiện

5.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc (ISO 7937)

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

1. Cân 25g thực phẩm, hòa vào 225mL dung dịch BPW
2. Lắc đều và để ổn định trong 10 phút
3. Tiến hành pha loãng thập phân liên tiếp (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³…)

Bước 2: Cấy mẫu lên môi trường chọn lọc

• Chọn 2 – 3 mức pha loãng phù hợp
• Dùng phương pháp đổ đĩa (Pour Plate Method) với TSC Agar
• Ủ kỵ khí ở 37°C trong 24 ± 2 giờ

Bước 3: Đếm khuẩn lạc đặc trưng

• Khuẩn lạc Clostridium perfringens trên TSC Agar có đặc điểm:
  • Màu xám đến đen do phản ứng với sulfite
  • Không có vòng kết tủa lecithinase
• Chọn các đĩa có 30 – 300 khuẩn lạc để đếm

Bước 4: Xác nhận sinh hóa

• Test motility (-) hoặc yếu
• Oxidase (-), Catalase (-)
• Khả năng sinh H₂S (+)
• Lên men glucose, lactose (+)

Bước 5: Tính kết quả

N=∑C(n1+0,1n2)×dN = \frac{\sum C}{(n_1 + 0,1 n_2) \times d}

Trong đó:

• ∑C\sum C = Tổng số khuẩn lạc đếm được
• n1n_1 = Số đĩa ở độ pha loãng thấp hơn
• n2n_2 = Số đĩa ở độ pha loãng cao hơn
• dd = Hệ số pha loãng của độ pha loãng thấp hơn

5.2. Phương pháp MPN (Most Probable Number)

1. Chuẩn bị 3 dãy ống nghiệm chứa môi trường FTM
2. Cấy 10mL, 1mL, và 0.1mL mẫu vào các dãy ống tương ứng
3. Ủ kỵ khí ở 37°C trong 24 – 48 giờ
4. Cấy ống dương tính lên môi trường TSC Agar
5. Đếm số ống dương tính và tra bảng MPN để tính kết quả