QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

Chỉ tiêu Nền mẫu Giới hạn định lượng/ phạm vi đo Kỹ thuật/ Phương pháp phân tích
Phát hiện Clostridium spp. /Detection of Clostridium spp. Thực phẩm(3),(4) Food 3 CFU/g (mL) PHE ID8/ISSUE No. 4.1: 2016
Định lượng Clostridium perfringens Phương pháp lọc qua màng /Enumeration of Clostridium perfringens Membrane filtration method Nước uống đóng chai, nước khoáng, nước sạch, nước sản xuất và chế biến, nước mặt, nước nuôi trồng thủy sản, nước đá(3),(4) /Bottled drinking water, mineral water, domestic water, processing water, surface water, water on fisheries cultivated area and ice water 1 CFU/ 100 mL 1CFU/ 250mL ISO 14189: 2013
Phát hiện Clostridium botulinum /Detection of Clostridium botulinum Thực phẩm, mẫu môi trường Food and environmental samples 4 CFU/g (mL) 4 CFU/25g (25mL) AOAC 977.26
Định lượng Clostridium perfringens Kỹ thuât đếm khuẩn lạc /Enumeration of Clostridium perfringens Colony count technique Thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản(3) Animal feed and aqua feed 10 CFU/g 1 CFU/mL ISO 15213-2: 2024
Định lượng Clostridium perfringens Kỹ thuât đếm khuẩn lạc /Enumeration of Clostridium perfringens Colony count technique Thực phẩm và mẫu môi trường(3),(4) Food and environmental samples 10 CFU/g 1 CFU/mL 10 CFU/ mẫu (Sample) ISO 15213-2: 2023

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

(Theo tiêu chuẩn ISO 7937:2004 & TCVN 4991:2005)

1. Giới thiệu về Clostridium perfringens

Clostridium perfringens là vi khuẩn Gram dương, kỵ khí, hình que, có khả năng tạo bào tử. Đây là một tác nhân chính gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt trong các thực phẩm chế biến sẵn, thịt, gia cầm, sản phẩm từ sữa và thực phẩm đóng hộp.

Vi khuẩn này gây bệnh thông qua việc sản xuất độc tố trong ruột non, với các triệu chứng như tiêu chảy, đau bụng và nôn mửa.

2. Tiêu chuẩn áp dụng

  • ISO 7937:2004 – Phương pháp định lượng Clostridium perfringens
  • TCVN 4991:2005 – Phương pháp phát hiện Clostridium perfringens trong thực phẩm
  • QCVN 8-3:2012/BYT – Giới hạn vi sinh vật trong thực phẩm

3. Nguyên tắc phương pháp

Có hai phương pháp chính để kiểm nghiệm Clostridium perfringens:

  1. Phương pháp đếm khuẩn lạc (ISO 7937)
  2. Phương pháp MPN (Most Probable Number) – Định lượng vi khuẩn có mật độ thấp

Phương pháp đếm khuẩn lạc được sử dụng phổ biến hơn trong kiểm tra vi sinh thực phẩm.

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

  • Tủ ấm kỵ khí (37°C ± 1°C, có điều kiện kỵ khí)
  • Tủ an toàn sinh học cấp II
  • Máy đếm khuẩn lạc, pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy

4.2. Môi trường nuôi cấy

  • Tryptose Sulfite Cycloserine Agar (TSC Agar) – Môi trường chọn lọc đặc trưng
  • Sulfite Polymyxin Sulfadiazine (SPS Agar) – Môi trường chọn lọc khác
  • Fluid Thioglycolate Medium (FTM) – Môi trường tăng sinh
  • Buffered Peptone Water (BPW) – Dung dịch pha loãng
  • Blood Agar (BA) – Kiểm tra hemolysis

5. Quy trình thực hiện

5.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc (ISO 7937)

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

  1. Cân 25g thực phẩm, hòa vào 225mL dung dịch BPW
  2. Lắc đều và để ổn định trong 10 phút
  3. Tiến hành pha loãng thập phân liên tiếp (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³…)

Bước 2: Cấy mẫu lên môi trường chọn lọc

  • Chọn 2 – 3 mức pha loãng phù hợp
  • Dùng phương pháp đổ đĩa (Pour Plate Method) với TSC Agar
  • Ủ kỵ khí ở 37°C trong 24 ± 2 giờ

Bước 3: Đếm khuẩn lạc đặc trưng

  • Khuẩn lạc Clostridium perfringens trên TSC Agar có đặc điểm:
    • Màu xám đến đen do phản ứng với sulfite
    • Không có vòng kết tủa lecithinase
  • Chọn các đĩa có 30 – 300 khuẩn lạc để đếm

Bước 4: Xác nhận sinh hóa

  • Test motility (-) hoặc yếu
  • Oxidase (-), Catalase (-)
  • Khả năng sinh H₂S (+)
  • Lên men glucose, lactose (+)

Bước 5: Tính kết quả

N=∑C(n1+0,1n2)×dN = \frac{\sum C}{(n_1 + 0,1 n_2) \times d}

Trong đó:

  • ∑C\sum C = Tổng số khuẩn lạc đếm được
  • n1n_1 = Số đĩa ở độ pha loãng thấp hơn
  • n2n_2 = Số đĩa ở độ pha loãng cao hơn
  • dd = Hệ số pha loãng của độ pha loãng thấp hơn

5.2. Phương pháp MPN (Most Probable Number)

  1. Chuẩn bị 3 dãy ống nghiệm chứa môi trường FTM
  2. Cấy 10mL, 1mL, và 0.1mL mẫu vào các dãy ống tương ứng
  3. Ủ kỵ khí ở 37°C trong 24 – 48 giờ
  4. Cấy ống dương tính lên môi trường TSC Agar
  5. Đếm số ống dương tính và tra bảng MPN để tính kết quả

6. Giới hạn vi khuẩn theo tiêu chuẩn

Sản phẩm Giới hạn Clostridium perfringens (CFU/g hoặc CFU/mL)
Thực phẩm chế biến sẵn < 10² CFU/g
Thịt, gia cầm sống < 10³ CFU/g
Sữa tươi Không có (0 CFU/25mL)
Hải sản tươi sống < 10² CFU/g

7. Ứng dụng

  • Giám sát an toàn thực phẩm
  • Kiểm tra chất lượng thực phẩm chế biến sẵn
  • Đánh giá ô nhiễm vi sinh trong ngành thực phẩm