• PHE ID8/ISSUE No. 4.1: 2016: Phát hiện Clostridium spp. /Detection of Clostridium spp.
• ISO 14189: 2013: Định lượng Clostridium perfringens Phương pháp lọc qua màng /Enumeration of Clostridium perfringens Membrane filtration method
• AOAC 977.26: Phát hiện Clostridium botulinum /Detection of Clostridium botulinum
• ISO 15213-2: 2024: Định lượng Clostridium perfringens Kỹ thuât đếm khuẩn lạc /Enumeration of Clostridium perfringens Colony count technique
• ISO 15213-2: 2023: Định lượng Clostridium perfringens Kỹ thuât đếm khuẩn lạc /Enumeration of Clostridium perfringens Colony count technique

• Tryptose Sulfite Cycloserine Agar (TSC Agar)
• Reinforced Clostridial Medium (RCM)
• Sulfite Polymyxin Sulfadiazine Agar (SPS Agar)
• Fluid Thioglycollate Medium (FTM)
• Blood Agar (BA)
• Cooked Meat Medium (CMM)

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM CLOSTRIDIUM SPP.

(Theo tiêu chuẩn ISO 15213:2003 & ISO 7937:2004)

1. Giới thiệu về Clostridium spp.

Clostridium là một chi vi khuẩn Gram dương, hình que, kỵ khí bắt buộc, có khả năng tạo bào tử, giúp chúng tồn tại trong điều kiện bất lợi. Một số loài quan trọng bao gồm:

• Clostridium perfringens – Gây ngộ độc thực phẩm và hoại thư sinh hơi
• Clostridium botulinum – Sản sinh độc tố botulinum gây liệt cơ
• Clostridium difficile – Liên quan đến tiêu chảy và viêm đại tràng giả mạc
• Clostridium sporogenes – Dùng làm chỉ thị kiểm tra độ tiệt trùng thực phẩm đóng hộp

2. Tiêu chuẩn áp dụng

• ISO 15213:2003 – Phát hiện và định lượng Clostridium spp.
• ISO 7937:2004 – Phương pháp định lượng Clostridium perfringens
• ISO 6887-1:2017 – Chuẩn bị mẫu vi sinh vật trong thực phẩm
• QCVN 8-3:2012/BYT – Giới hạn vi sinh vật trong thực phẩm

3. Nguyên tắc phương pháp

Tùy theo mục tiêu kiểm nghiệm, có thể áp dụng các phương pháp sau:

1. Phát hiện Clostridium spp. (ISO 15213) – Xác định sự có mặt của vi khuẩn
2. Định lượng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (ISO 7937) – Đo lường số lượng vi khuẩn trong mẫu
3. Phương pháp MPN (Most Probable Number) – Định lượng khi vi khuẩn có mật độ thấp

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

• Tủ ấm kỵ khí (37°C hoặc 44°C ± 1°C, có môi trường kỵ khí 5% CO₂, 10% H₂, 85% N₂)
• Tủ an toàn sinh học cấp II
• Máy vortex, pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy

4.2. Môi trường nuôi cấy

• Tryptose Sulfite Cycloserine Agar (TSC Agar) – Môi trường chọn lọc đặc trưng
• Reinforced Clostridial Medium (RCM) – Môi trường tăng sinh
• Sulfite Polymyxin Sulfadiazine Agar (SPS Agar) – Chọn lọc cho Clostridium perfringens
• Fluid Thioglycollate Medium (FTM) – Làm giàu vi khuẩn kỵ khí
• Blood Agar (BA) – Kiểm tra hemolysis
• Cooked Meat Medium (CMM) – Làm giàu đặc hiệu cho Clostridium

5. Quy trình thực hiện

5.1. Phương pháp phát hiện Clostridium spp. (ISO 15213)

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

1. Cân 25g mẫu thực phẩm, hòa vào 225mL Fluid Thioglycollate Medium (FTM)
2. Ủ kỵ khí ở 37°C trong 24 – 48 giờ

Bước 2: Cấy mẫu lên môi trường chọn lọc

• Cấy vạch lên TSC Agar hoặc SPS Agar
• Ủ kỵ khí ở 37°C trong 24 – 48 giờ

Bước 3: Kiểm tra khuẩn lạc đặc trưng

• Khuẩn lạc Clostridium thường có:
  • Màu đen trên TSC Agar (do khử sulfite thành sulfide)
  • Vòng kết tủa xung quanh trên SPS Agar

Bước 4: Xác nhận sinh hóa

• Oxidase (-), Catalase (-)
• Sinh H₂S (+) trên môi trường KIA (Kligler Iron Agar)
• Di động (+) trừ Clostridium perfringens

5.2. Phương pháp định lượng Clostridium spp. (ISO 7937)

Bước 1: Pha loãng mẫu

1. Cân 25g mẫu, hòa với 225mL nước peptone đệm (BPW)
2. Tiến hành pha loãng thập phân liên tiếp (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³…)

Bước 2: Cấy mẫu lên môi trường chọn lọc

• Cấy theo phương pháp đổ đĩa (Pour Plate) với TSC Agar
• Ủ kỵ khí ở 37°C trong 24 – 48 giờ

Bước 3: Đếm khuẩn lạc

• Chọn đĩa có 30 – 300 khuẩn lạc
• Khuẩn lạc Clostridium có màu đen trên TSC Agar

Bước 4: Tính kết quả

N=∑C(n1+0,1n2)×dN = \frac{\sum C}{(n_1 + 0,1 n_2) \times d}

5.3. Phương pháp MPN (Most Probable Number)

1. Chuẩn bị 3 dãy ống nghiệm chứa Reinforced Clostridial Medium (RCM)
2. Cấy 10mL, 1mL, và 0.1mL mẫu vào các dãy ống tương ứng
3. Ủ kỵ khí ở 37°C trong 24 – 48 giờ
4. Cấy ống dương tính lên môi trường TSC Agar
5. Đếm số ống dương tính và tra bảng MPN để tính kết quả