QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM CLOSTRIDIUM SPP

Chỉ tiêu Nền mẫu Giới hạn định lượng/ phạm vi đo Kỹ thuật/ Phương pháp phân tích
Phát hiện Clostridium spp. /Detection of Clostridium spp. Thực phẩm(3),(4) Food 3 CFU/g (mL) PHE ID8/ISSUE No. 4.1: 2016
Định lượng Clostridium perfringens Phương pháp lọc qua màng /Enumeration of Clostridium perfringens Membrane filtration method Nước uống đóng chai, nước khoáng, nước sạch, nước sản xuất và chế biến, nước mặt, nước nuôi trồng thủy sản, nước đá(3),(4) /Bottled drinking water, mineral water, domestic water, processing water, surface water, water on fisheries cultivated area and ice water 1 CFU/ 100 mL 1CFU/ 250mL ISO 14189: 2013
Phát hiện Clostridium botulinum /Detection of Clostridium botulinum Thực phẩm, mẫu môi trường Food and environmental samples 4 CFU/g (mL) 4 CFU/25g (25mL) AOAC 977.26
Định lượng Clostridium perfringens Kỹ thuât đếm khuẩn lạc /Enumeration of Clostridium perfringens Colony count technique Thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản(3) Animal feed and aqua feed 10 CFU/g 1 CFU/mL ISO 15213-2: 2024
Định lượng Clostridium perfringens Kỹ thuât đếm khuẩn lạc /Enumeration of Clostridium perfringens Colony count technique Thực phẩm và mẫu môi trường(3),(4) Food and environmental samples 10 CFU/g 1 CFU/mL 10 CFU/ mẫu (Sample) ISO 15213-2: 2023

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM CLOSTRIDIUM SPP.

(Theo tiêu chuẩn ISO 15213:2003 & ISO 7937:2004)

1. Giới thiệu về Clostridium spp.

Clostridium là một chi vi khuẩn Gram dương, hình que, kỵ khí bắt buộc, có khả năng tạo bào tử, giúp chúng tồn tại trong điều kiện bất lợi. Một số loài quan trọng bao gồm:

  • Clostridium perfringens – Gây ngộ độc thực phẩm và hoại thư sinh hơi
  • Clostridium botulinum – Sản sinh độc tố botulinum gây liệt cơ
  • Clostridium difficile – Liên quan đến tiêu chảy và viêm đại tràng giả mạc
  • Clostridium sporogenes – Dùng làm chỉ thị kiểm tra độ tiệt trùng thực phẩm đóng hộp

2. Tiêu chuẩn áp dụng

  • ISO 15213:2003 – Phát hiện và định lượng Clostridium spp.
  • ISO 7937:2004 – Phương pháp định lượng Clostridium perfringens
  • ISO 6887-1:2017 – Chuẩn bị mẫu vi sinh vật trong thực phẩm
  • QCVN 8-3:2012/BYT – Giới hạn vi sinh vật trong thực phẩm

3. Nguyên tắc phương pháp

Tùy theo mục tiêu kiểm nghiệm, có thể áp dụng các phương pháp sau:

  1. Phát hiện Clostridium spp. (ISO 15213) – Xác định sự có mặt của vi khuẩn
  2. Định lượng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (ISO 7937) – Đo lường số lượng vi khuẩn trong mẫu
  3. Phương pháp MPN (Most Probable Number) – Định lượng khi vi khuẩn có mật độ thấp

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

  • Tủ ấm kỵ khí (37°C hoặc 44°C ± 1°C, có môi trường kỵ khí 5% CO₂, 10% H₂, 85% N₂)
  • Tủ an toàn sinh học cấp II
  • Máy vortex, pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy

4.2. Môi trường nuôi cấy

  • Tryptose Sulfite Cycloserine Agar (TSC Agar) – Môi trường chọn lọc đặc trưng
  • Reinforced Clostridial Medium (RCM) – Môi trường tăng sinh
  • Sulfite Polymyxin Sulfadiazine Agar (SPS Agar) – Chọn lọc cho Clostridium perfringens
  • Fluid Thioglycollate Medium (FTM) – Làm giàu vi khuẩn kỵ khí
  • Blood Agar (BA) – Kiểm tra hemolysis
  • Cooked Meat Medium (CMM) – Làm giàu đặc hiệu cho Clostridium

5. Quy trình thực hiện

5.1. Phương pháp phát hiện Clostridium spp. (ISO 15213)

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

  1. Cân 25g mẫu thực phẩm, hòa vào 225mL Fluid Thioglycollate Medium (FTM)
  2. Ủ kỵ khí ở 37°C trong 24 – 48 giờ

Bước 2: Cấy mẫu lên môi trường chọn lọc

  • Cấy vạch lên TSC Agar hoặc SPS Agar
  • Ủ kỵ khí ở 37°C trong 24 – 48 giờ

Bước 3: Kiểm tra khuẩn lạc đặc trưng

  • Khuẩn lạc Clostridium thường có:
    • Màu đen trên TSC Agar (do khử sulfite thành sulfide)
    • Vòng kết tủa xung quanh trên SPS Agar

Bước 4: Xác nhận sinh hóa

  • Oxidase (-), Catalase (-)
  • Sinh H₂S (+) trên môi trường KIA (Kligler Iron Agar)
  • Di động (+) trừ Clostridium perfringens

5.2. Phương pháp định lượng Clostridium spp. (ISO 7937)

Bước 1: Pha loãng mẫu

  1. Cân 25g mẫu, hòa với 225mL nước peptone đệm (BPW)
  2. Tiến hành pha loãng thập phân liên tiếp (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³…)

Bước 2: Cấy mẫu lên môi trường chọn lọc

  • Cấy theo phương pháp đổ đĩa (Pour Plate) với TSC Agar
  • Ủ kỵ khí ở 37°C trong 24 – 48 giờ

Bước 3: Đếm khuẩn lạc

  • Chọn đĩa có 30 – 300 khuẩn lạc
  • Khuẩn lạc Clostridium có màu đen trên TSC Agar

Bước 4: Tính kết quả

N=∑C(n1+0,1n2)×dN = \frac{\sum C}{(n_1 + 0,1 n_2) \times d}

5.3. Phương pháp MPN (Most Probable Number)

  1. Chuẩn bị 3 dãy ống nghiệm chứa Reinforced Clostridial Medium (RCM)
  2. Cấy 10mL, 1mL, và 0.1mL mẫu vào các dãy ống tương ứng
  3. Ủ kỵ khí ở 37°C trong 24 – 48 giờ
  4. Cấy ống dương tính lên môi trường TSC Agar
  5. Đếm số ống dương tính và tra bảng MPN để tính kết quả

6. Giới hạn vi khuẩn theo tiêu chuẩn

Sản phẩm Giới hạn Clostridium spp. (CFU/g hoặc CFU/mL)
Thực phẩm chế biến sẵn < 10² CFU/g
Thịt, gia cầm sống < 10³ CFU/g
Sữa tươi Không có (0 CFU/25mL)
Thực phẩm đóng hộp Không có (0 CFU/g)

7. Ứng dụng

  • Kiểm tra an toàn thực phẩm
  • Giám sát vi sinh vật trong thực phẩm đóng hộp
  • Kiểm tra nước và môi trường sản xuất thực phẩm