Quy trình kiểm nghiệm Listeria spp

• ISO 11290 – 2: 2017: Định lượng Listeria monocytogenes Kỹ thuật cấy trải /Enumeration of Listeria monocytogenes Spread plate technique
• ISO 11290 – 1: 2017: Phát hiện Listeria spp. và Listeria monocytogenes(3) /Detection of Listeria spp. and Listeria monocytogenes
• ГOCT P 51921:2002: Phát hiện Listeria spp. và Listeria monocytogenes(3) /Detection of Listeria spp. and Listeria monocytogenes
• ГOCT P 51921:2002: Phát hiện Listeria spp. và Listeria monocytogenes /Detection of Listeria spp. and Listeria monocytogenes
• MFHPB 30: 2011: Phát hiện Listeria spp. Phương pháp PCR /Detection of Listeria spp. PCR method

• Half-Fraser Broth.
• Fraser Broth.
• ALOA (Agar Listeria Ottaviani & Agosti)
• PALCAM
• Oxford Agar

1. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

• Thu thập mẫu thực phẩm (thịt, sữa, rau củ, thủy sản, thực phẩm chế biến…) theo quy trình lấy mẫu chuẩn.
• Cân 25g mẫu thực phẩm, đồng nhất trong 225ml môi trường đệm Half-Fraser Broth.
• Lắc đều và để yên trước khi thực hiện bước tiếp theo.

2. Tiền môi trường tăng sinh không chọn lọc (Pre-enrichment)

• Môi trường sử dụng: Half-Fraser Broth.
• Ủ ở 30°C trong 24 giờ.
• Mục đích: Tạo điều kiện cho Listeria spp. phát triển nếu có trong mẫu.

3. Tăng sinh chọn lọc (Selective enrichment)

• Chuyển 0,1ml dịch Half-Fraser Broth vào 10ml môi trường Full-Fraser Broth.
• Ủ 37°C trong 24 giờ.
• Giúp tăng sinh số lượng Listeria spp. trước khi phân lập.

4. Cấy phân lập trên môi trường chọn lọc

• Môi trường ALOA (Agar Listeria Ottaviani & Agosti):
  • Listeria monocytogenes: Khuẩn lạc màu xanh dương với quầng đục trắng.
• Môi trường PALCAM (Polymyxin Acriflavine Lithium Chloride Ceftazidime Aesculin Mannitol Agar):
  • Listeria spp.: Khuẩn lạc màu xám xanh với vòng đen.
• Môi trường Oxford Agar:
  • Listeria spp.: Khuẩn lạc màu đen với vòng sáng.
• Ủ 37°C trong 24-48 giờ.

5. Kiểm tra sinh hóa

• Thử nghiệm Oxidase: Âm tính (-).
• Thử nghiệm Catalase: Dương tính (+).
• Thử nghiệm β-hemolysis trên Blood Agar:
  • Listeria monocytogenes: Dương tính (+).
• Thử nghiệm CAMP với Staphylococcus aureus: Dương tính (+).
• Định danh bằng API Listeria hoặc VITEK nếu cần.

6. Xác nhận bằng PCR hoặc ELISA (nếu cần)

• Dùng PCR để phát hiện gene đặc hiệu hlyA (Listeria monocytogenes).
• ELISA có thể sử dụng để phát hiện kháng nguyên Listeria.

7. Khẳng định và báo cáo kết quả

• Nếu phát hiện Listeria monocytogenes, cần đánh giá mức độ nguy cơ theo quy định của thực phẩm.
• So sánh với giới hạn vi sinh cho phép theo TCVN hoặc tiêu chuẩn quốc tế.