• ISO 15190:2020 – Yêu cầu an toàn sinh học trong phòng thí nghiệm vi sinh
• ISO 11731:2017 – Phát hiện Mycobacteria trong môi trường nước
• WHO TB Laboratory Manual – Hướng dẫn kiểm nghiệm lao của WHO
• USP <963> – Phát hiện Mycobacteria trong sản phẩm sinh học

• Lowenstein-Jensen (LJ) Medium
• Middlebrook 7H10, 7H11 Agar
• Middlebrook 7H9 Broth
• MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube)

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM MYCOBACTERIA

(Theo tiêu chuẩn ISO 15190:2020, ISO 11731:2017, USP <963>, WHO TB Laboratory Manual)

1. Giới thiệu về Mycobacteria

Mycobacteria là nhóm vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, có đặc điểm nổi bật là thành tế bào chứa nhiều lipid, giúp chúng kháng lại nhiều hóa chất và kháng sinh.

Một số loài Mycobacteria quan trọng:

• Mycobacterium tuberculosis – Gây bệnh lao
• Mycobacterium leprae – Gây bệnh phong (hủi)
• Mycobacterium avium complex (MAC) – Gây nhiễm trùng cơ hội ở người suy giảm miễn dịch
• Mycobacterium bovis – Lây từ động vật sang người qua thực phẩm bị nhiễm khuẩn

2. Tiêu chuẩn áp dụng

• ISO 15190:2020 – Yêu cầu an toàn sinh học trong phòng thí nghiệm vi sinh
• ISO 11731:2017 – Phát hiện Mycobacteria trong môi trường nước
• WHO TB Laboratory Manual – Hướng dẫn kiểm nghiệm lao của WHO
• USP <963> – Phát hiện Mycobacteria trong sản phẩm sinh học

3. Nguyên tắc phương pháp

Có ba phương pháp chính để kiểm nghiệm Mycobacteria:

1. Nhuộm soi kính hiển vi – Sàng lọc nhanh bằng nhuộm Ziehl-Neelsen hoặc Auramine
2. Nuôi cấy trên môi trường đặc trưng – Xác định sự phát triển của vi khuẩn
3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) – Xác nhận nhanh sự có mặt của Mycobacteria

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

• Tủ an toàn sinh học cấp III (đối với M. tuberculosis)
• Kính hiển vi huỳnh quang hoặc trường sáng
• Tủ ấm CO₂ (37°C ± 1°C)
• Máy PCR (nếu dùng phương pháp PCR)

4.2. Môi trường nuôi cấy

• Lowenstein-Jensen (LJ) Medium – Nuôi cấy Mycobacteria (rắn)
• Middlebrook 7H10, 7H11 Agar – Môi trường rắn cho vi khuẩn lao
• Middlebrook 7H9 Broth – Môi trường lỏng để phát hiện nhanh
• MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) – Dùng cho hệ thống nuôi cấy tự động

5. Quy trình kiểm nghiệm

5.1. Phương pháp nhuộm soi kính hiển vi

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

• Mẫu bệnh phẩm: Đờm, nước tiểu, dịch não tủy, mô bệnh phẩm
• Mẫu môi trường: Nước uống, nước hồ, đất

Bước 2: Nhuộm Ziehl-Neelsen hoặc Auramine

1. Cố định tiêu bản bằng nhiệt
2. Nhuộm bằng fuchsin carbolic (Ziehl-Neelsen) hoặc auramine-rhodamine (huỳnh quang)
3. Tẩy màu bằng acid-alcohol
4. Nhuộm nền bằng xanh methylene

Bước 3: Quan sát dưới kính hiển vi

• Mycobacteria bắt màu đỏ trên nền xanh (Ziehl-Neelsen)
• Hoặc phát sáng vàng dưới UV (Auramine)

📌 Ưu điểm: Phát hiện nhanh trong vài giờ

5.2. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc trưng

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

• Xử lý mẫu bằng NaOH 4% để loại bỏ vi khuẩn không phải Mycobacteria
• Ly tâm, thu lấy cặn để nuôi cấy

Bước 2: Cấy mẫu vào môi trường

1. Cấy vào Lowenstein-Jensen (LJ) Medium
2. Cấy vào Middlebrook 7H10 hoặc 7H9 nếu dùng hệ thống tự động

Bước 3: Ủ ở 37°C trong 4 – 8 tuần

• Quan sát khuẩn lạc có đặc điểm khô, dạng sáp, phát triển chậm

📌 Ưu điểm: Tiêu chuẩn vàng để phát hiện Mycobacteria nhưng mất nhiều thời gian

5.3. Phương pháp PCR phát hiện Mycobacteria

1. Chiết xuất DNA từ mẫu bệnh phẩm hoặc nước
2. Khuếch đại gen IS6110 (đặc hiệu cho M. tuberculosis)
3. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
4. So sánh với mẫu đối chứng dương tính và âm tính