Phương pháp áp dụng

Môi trường sử dụng

Quy trình thực hiện

SMEWW 9610 (D): 2023: Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc Phương pháp lọc qua màng /Enumeration of yeasts and molds Membrane filtration method
ICUMSA GS2/3-47: 2015: Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc Kỹ thuật đổ đĩa và lọc qua màng /Enumeration of yeasts and molds Colony count and membrance filtration technique
TCVN 12272: 2018: Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc Kỹ thuật cấy trải /Enumeration of yeasts and molds Spread plate technique
AOAC 2002.11: Phát hiện tổng số nấm men, nấm mốc /Detection of yeasts and molds
NAFI6/VS09: 2019 (Ref. BKR 23/11 – 12/18): Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc Kỹ thuật cấy trải /Enumeration of yeasts and molds Spread plate technique
ISO 21527 – 1,2: 2008: Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc Kỹ thuật cấy trải /Enumeration of yeasts and molds Spread plate technique
NAFI6/VS13: 2018 (Ref. ISO 21527 – 1,2: 2008): Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc Kỹ thuật cấy trải /Enumeration of yeasts and molds Spread plate technique
ISO 21527 – 1,2: 2008: Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc Kỹ thuật cấy trải /Enumeration of yeasts and molds Spread plate technique

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM NẤM MEN VÀ NẤM MỐC (YEAST & MOLD)

(Theo tiêu chuẩn ISO 21527-1:2008, ISO 21527-2:2008, USP <61> & <62>, FDA BAM Chapter 18, AOAC 997.02)

1. Giới thiệu về nấm men và nấm mốc

Nấm men (Yeast): Vi sinh vật đơn bào, có thể sinh trưởng trong môi trường giàu dinh dưỡng, có khả năng lên men và phát triển ở pH thấp.
Nấm mốc (Mold): Vi sinh vật đa bào, phát triển mạnh trong điều kiện ẩm ướt, có thể sinh bào tử và gây hư hỏng thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm.

📌 Mối nguy: Một số chủng nấm mốc có thể sản sinh độc tố (mycotoxin), ảnh hưởng đến sức khỏe con người khi tiêu thụ thực phẩm hoặc tiếp xúc lâu dài.

2. Tiêu chuẩn áp dụng

ISO 21527-1:2008 – Phương pháp kiểm tra nấm men & nấm mốc trong thực phẩm có độ ẩm thấp (< 0.95 aw).
ISO 21527-2:2008 – Phương pháp kiểm tra nấm men & nấm mốc trong thực phẩm có độ ẩm cao (> 0.95 aw).
USP <61> & USP <62> – Kiểm tra vi sinh trong dược phẩm, mỹ phẩm.
FDA BAM Chapter 18 – Hướng dẫn kiểm nghiệm nấm men và nấm mốc trong thực phẩm.
AOAC 997.02 – Phương pháp kiểm tra vi sinh trong thực phẩm.

3. Nguyên tắc phương pháp

Có hai phương pháp chính để kiểm nghiệm nấm men & nấm mốc:

Phương pháp nuôi cấy đếm khuẩn lạc (Plate Count Method): Sử dụng môi trường chọn lọc để nuôi cấy và định lượng.
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction): Phát hiện nhanh nấm mốc có khả năng sinh độc tố.

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

Tủ ấm (25°C – 30°C)
Tủ an toàn sinh học cấp II
Pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy, máy vortex

4.2. Môi trường nuôi cấy

Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC) Agar – Môi trường chọn lọc cho nấm men & nấm mốc trong thực phẩm có độ ẩm thấp.
Potato Dextrose Agar (PDA) – Môi trường nuôi cấy tổng quát cho nấm men & nấm mốc.
Sabouraud Dextrose Agar (SDA) – Môi trường nuôi cấy nấm men trong dược phẩm.
Malt Extract Agar (MEA) – Kiểm tra nấm mốc trong mỹ phẩm.

5. Quy trình kiểm nghiệm

5.1. Kiểm nghiệm bằng phương pháp nuôi cấy

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

Thực phẩm (10g mẫu): Pha loãng với 90mL Peptone Water (0.1%)
Nước uống (100mL mẫu): Lọc qua màng 0.45µm, đặt màng lên môi trường nuôi cấy
Mỹ phẩm/Dược phẩm (10g mẫu): Hòa tan vào 90mL Peptone Water hoặc TSB

Bước 2: Cấy mẫu và ủ vi khuẩn

Dùng 1mL hoặc 0.1mL dịch pha loãng cấy lên DRBC Agar hoặc PDA
Trải đều bằng que gạt vô trùng
Ủ 25 – 30°C trong 3 – 5 ngày (tối đa 7 ngày)

Bước 3: Đếm khuẩn lạc

Nấm men: Khuẩn lạc tròn, mịn, bóng
Nấm mốc: Khuẩn lạc xù xì, có thể có sắc tố (xanh, đen, trắng, vàng, đỏ)

📌 Ưu điểm: Phương pháp tiêu chuẩn, có độ chính xác cao.

5.2. Kiểm nghiệm bằng phương pháp PCR

Bước 1: Chiết xuất DNA từ mẫu

Dùng bộ kit chiết xuất DNA từ nấm mốc/nấm men trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc nước.

Bước 2: Khuếch đại DNA bằng PCR

Sử dụng mồi đặc hiệu cho nấm mốc sinh độc tố như Aspergillus flavus, Fusarium spp., Penicillium spp.

Bước 3: Điện di sản phẩm PCR

So sánh với mẫu đối chứng để xác nhận sự có mặt của nấm mốc có khả năng sinh độc tố.

📌 Ưu điểm: Phát hiện nhanh trong 24 – 48 giờ, xác định được chủng nấm mốc nguy hiểm.