QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM NẤM MEN VÀ NẤM MỐC (YEAST & MOLD)

Chỉ tiêu Nền mẫu Giới hạn định lượng/ phạm vi đo Kỹ thuật/ Phương pháp phân tích
Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc Phương pháp lọc qua màng /Enumeration of yeasts and molds Membrane filtration method Nước uống đóng chai, nước khoáng, nước sạch, nước sản xuất và chế biến, nước mặt, nước nuôi trồng thủy sản, nước đá(3),(4) Bottled drinking water, mineral water, domestic water, processing water, surface water, water on fisheries cultivated area and ice water 1 CFU/ 100 mL 1CFU/ 250mL SMEWW 9610 (D): 2023
Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc Kỹ thuật đổ đĩa và lọc qua màng /Enumeration of yeasts and molds Colony count and membrance filtration technique Đường Sugar 10 CFU/10g (10mL ICUMSA GS2/3-47: 2015
Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc Kỹ thuật cấy trải /Enumeration of yeasts and molds Spread plate technique Đũa ăn Chopsticks 10 CFU/g TCVN 12272: 2018
Phát hiện tổng số nấm men, nấm mốc /Detection of yeasts and molds Thực phẩm(3),(4) Food 3 CFU/g (mL) AOAC 2002.11
Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc Kỹ thuật cấy trải /Enumeration of yeasts and molds Spread plate technique Thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, thức ăn thủy sản(3),(4) Food, animal feed and aqua feed 10 CFU/g 1 CFU/mL NAFI6/VS09: 2019 (Ref. BKR 23/11 – 12/18)
Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc Kỹ thuật cấy trải /Enumeration of yeasts and molds Spread plate technique Thức ăn chăn nuôi và thức ăn thủy sản(3) Animal feed and aqua feed 10 CFU/g 1 CFU/mL ISO 21527 – 1,2: 2008
Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc Kỹ thuật cấy trải /Enumeration of yeasts and molds Spread plate technique Mẫu môi trường(3) Environmental samples 10 CFU/ mẫu (Sample) NAFI6/VS13: 2018 (Ref. ISO 21527 – 1,2: 2008)
Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc Kỹ thuật cấy trải /Enumeration of yeasts and molds Spread plate technique Thực phẩm(3),(4) Food and environmental samples 10 CFU/g 1 CFU/mL ISO 21527 – 1,2: 2008

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM NẤM MEN VÀ NẤM MỐC (YEAST & MOLD)

(Theo tiêu chuẩn ISO 21527-1:2008, ISO 21527-2:2008, USP <61> & <62>, FDA BAM Chapter 18, AOAC 997.02)

1. Giới thiệu về nấm men và nấm mốc

  • Nấm men (Yeast): Vi sinh vật đơn bào, có thể sinh trưởng trong môi trường giàu dinh dưỡng, có khả năng lên men và phát triển ở pH thấp.
  • Nấm mốc (Mold): Vi sinh vật đa bào, phát triển mạnh trong điều kiện ẩm ướt, có thể sinh bào tử và gây hư hỏng thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm.

📌 Mối nguy: Một số chủng nấm mốc có thể sản sinh độc tố (mycotoxin), ảnh hưởng đến sức khỏe con người khi tiêu thụ thực phẩm hoặc tiếp xúc lâu dài.

2. Tiêu chuẩn áp dụng

  • ISO 21527-1:2008 – Phương pháp kiểm tra nấm men & nấm mốc trong thực phẩm có độ ẩm thấp (< 0.95 aw).
  • ISO 21527-2:2008 – Phương pháp kiểm tra nấm men & nấm mốc trong thực phẩm có độ ẩm cao (> 0.95 aw).
  • USP <61> & USP <62> – Kiểm tra vi sinh trong dược phẩm, mỹ phẩm.
  • FDA BAM Chapter 18 – Hướng dẫn kiểm nghiệm nấm men và nấm mốc trong thực phẩm.
  • AOAC 997.02 – Phương pháp kiểm tra vi sinh trong thực phẩm.

3. Nguyên tắc phương pháp

Có hai phương pháp chính để kiểm nghiệm nấm men & nấm mốc:

  1. Phương pháp nuôi cấy đếm khuẩn lạc (Plate Count Method): Sử dụng môi trường chọn lọc để nuôi cấy và định lượng.
  2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction): Phát hiện nhanh nấm mốc có khả năng sinh độc tố.

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

  • Tủ ấm (25°C – 30°C)
  • Tủ an toàn sinh học cấp II
  • Pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy, máy vortex

4.2. Môi trường nuôi cấy

  • Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC) Agar – Môi trường chọn lọc cho nấm men & nấm mốc trong thực phẩm có độ ẩm thấp.
  • Potato Dextrose Agar (PDA) – Môi trường nuôi cấy tổng quát cho nấm men & nấm mốc.
  • Sabouraud Dextrose Agar (SDA) – Môi trường nuôi cấy nấm men trong dược phẩm.
  • Malt Extract Agar (MEA) – Kiểm tra nấm mốc trong mỹ phẩm.

5. Quy trình kiểm nghiệm

5.1. Kiểm nghiệm bằng phương pháp nuôi cấy

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

  • Thực phẩm (10g mẫu): Pha loãng với 90mL Peptone Water (0.1%)
  • Nước uống (100mL mẫu): Lọc qua màng 0.45µm, đặt màng lên môi trường nuôi cấy
  • Mỹ phẩm/Dược phẩm (10g mẫu): Hòa tan vào 90mL Peptone Water hoặc TSB

Bước 2: Cấy mẫu và ủ vi khuẩn

  • Dùng 1mL hoặc 0.1mL dịch pha loãng cấy lên DRBC Agar hoặc PDA
  • Trải đều bằng que gạt vô trùng
  • Ủ 25 – 30°C trong 3 – 5 ngày (tối đa 7 ngày)

Bước 3: Đếm khuẩn lạc

  • Nấm men: Khuẩn lạc tròn, mịn, bóng
  • Nấm mốc: Khuẩn lạc xù xì, có thể có sắc tố (xanh, đen, trắng, vàng, đỏ)

📌 Ưu điểm: Phương pháp tiêu chuẩn, có độ chính xác cao.

5.2. Kiểm nghiệm bằng phương pháp PCR

Bước 1: Chiết xuất DNA từ mẫu

  • Dùng bộ kit chiết xuất DNA từ nấm mốc/nấm men trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc nước.

Bước 2: Khuếch đại DNA bằng PCR

  • Sử dụng mồi đặc hiệu cho nấm mốc sinh độc tố như Aspergillus flavus, Fusarium spp., Penicillium spp.

Bước 3: Điện di sản phẩm PCR

  • So sánh với mẫu đối chứng để xác nhận sự có mặt của nấm mốc có khả năng sinh độc tố.

📌 Ưu điểm: Phát hiện nhanh trong 24 – 48 giờ, xác định được chủng nấm mốc nguy hiểm.

6. Giới hạn kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn

Mẫu kiểm nghiệm Giới hạn nấm men & nấm mốc
Nước uống Không có (0 CFU/100mL)
Mỹ phẩm ≤ 10³ CFU/g hoặc mL
Dược phẩm ≤ 10² CFU/g hoặc mL
Thực phẩm chế biến ≤ 10³ CFU/g

7. Ứng dụng

  • Kiểm tra thực phẩm, nước uống để phòng tránh ô nhiễm nấm mốc.
  • Đánh giá chất lượng vi sinh trong mỹ phẩm, dược phẩm.
  • Kiểm tra môi trường sản xuất nhằm kiểm soát an toàn vi sinh.

 

Danh mục môi trường vi sinh sử dụng kiểm nghiệm Men mốc

Ringer’s solution
Peptone water
Buffered Peptone Water
DG-18 Agar
Dichloran Glycerol Agar Base
Plate count agar
Malt Extract Agar
Potato dextrose agar
Oxytetracycline Glucose Yeast Extract Agar
Potato Carrot Bile Agar
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol and Gentamicin
Sabouraud Agar
YGC (Yeast Glucose Chloramphenicol) Agar
Rose Bengal Chloramphenicol Agar
Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol