• ISO 16266: 2006: Định lượng Pseudomonas aeruginosa Phương pháp lọc qua màng /Enumeration of Pseudomonas aeruginosa Membrane filtration method
• ISO 16266:2006 – Phát hiện Pseudomonas aeruginosa trong nước
• ISO 13720:2010 – Xác định Pseudomonas trong thịt và sản phẩm từ thịt
• USP <62> & AOAC 991.47 – Kiểm tra Pseudomonas aeruginosa trong dược phẩm và mỹ phẩm
• TCVN 7924-1:2008 – Kiểm nghiệm Pseudomonas aeruginosa trong thực phẩm

• Cetrimide Agar
• King’s A & King’s B Medium
• Pseudomonas Broth (PB)
• R2A Agar

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM PSEUDOMONAS

(Theo tiêu chuẩn ISO 16266:2006, ISO 13720:2010, USP <62>, AOAC 991.47)

1. Giới thiệu về Pseudomonas

Pseudomonas là nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, có khả năng sống trong nhiều môi trường khác nhau. Một số loài quan trọng bao gồm:

• Pseudomonas aeruginosa – Gây bệnh nhiễm trùng cơ hội, nhiễm trùng bệnh viện
• Pseudomonas fluorescens – Liên quan đến hư hỏng thực phẩm
• Pseudomonas putida – Có vai trò trong xử lý sinh học

Vi khuẩn này có khả năng kháng nhiều loại kháng sinh và thường được tìm thấy trong nước, thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và môi trường y tế.

2. Tiêu chuẩn áp dụng

• ISO 16266:2006 – Phát hiện Pseudomonas aeruginosa trong nước
• ISO 13720:2010 – Xác định Pseudomonas trong thịt và sản phẩm từ thịt
• USP <62> & AOAC 991.47 – Kiểm tra Pseudomonas aeruginosa trong dược phẩm và mỹ phẩm
• TCVN 7924-1:2008 – Kiểm nghiệm Pseudomonas aeruginosa trong thực phẩm

3. Nguyên tắc phương pháp

Có ba phương pháp chính để kiểm nghiệm Pseudomonas:

1. Nuôi cấy trên môi trường đặc trưng – Xác định sự có mặt của vi khuẩn
2. Phương pháp MPN (Most Probable Number) – Định lượng Pseudomonas trong mẫu
3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) – Xác nhận nhanh sự có mặt của vi khuẩn

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

• Tủ ấm hiếu khí (37°C ± 1°C)
• Tủ an toàn sinh học cấp II
• Pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy, máy vortex

4.2. Môi trường nuôi cấy

• Cetrimide Agar – Môi trường chọn lọc cho Pseudomonas aeruginosa
• King’s A & King’s B Medium – Kiểm tra huỳnh quang và sắc tố pyocyanin
• Pseudomonas Broth (PB) – Môi trường tăng sinh
• R2A Agar – Dùng trong kiểm nghiệm nước

5. Quy trình kiểm nghiệm

5.1. Phát hiện Pseudomonas bằng nuôi cấy

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

• Mẫu nước: Lọc 100mL nước qua màng lọc 0.45 µm
• Mẫu thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm: Cân 25g mẫu, pha loãng với 225mL Pseudomonas Broth (PB)

Bước 2: Cấy mẫu lên môi trường chọn lọc

• Cấy mẫu lên Cetrimide Agar
• Ủ ở 37°C trong 24 – 48 giờ

Bước 3: Kiểm tra khuẩn lạc đặc trưng

• Pseudomonas aeruginosa tạo khuẩn lạc xanh lá hoặc xanh lam do sắc tố pyocyanin
• Kiểm tra huỳnh quang dưới đèn UV trên King’s B Medium

📌 Ưu điểm: Phương pháp đơn giản, tiêu chuẩn quốc tế

5.2. Định lượng Pseudomonas bằng phương pháp MPN

1. Chuẩn bị 3 dãy ống nghiệm chứa Pseudomonas Broth (PB)
2. Cấy 10mL, 1mL, 0.1mL mẫu vào các dãy ống
3. Ủ ở 37°C trong 48 giờ
4. Cấy tiếp lên Cetrimide Agar để xác nhận
5. Đếm số ống dương tính và tra bảng MPN để tính kết quả

📌 Ưu điểm: Định lượng chính xác trong nước và thực phẩm

5.3. Phương pháp PCR phát hiện Pseudomonas

1. Chiết xuất DNA từ mẫu bệnh phẩm, thực phẩm hoặc nước
2. Khuếch đại gen đặc hiệu 16S rRNA của Pseudomonas
3. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
4. So sánh với mẫu đối chứng dương tính và âm tính