• SMEWW 9213 (B): 2023: Định lượng Staphylococci và Staphylococcus aureus Phương pháp lọc qua màng – qui trình 6.a /Enumeration of Staphylococci and Staphylococcus aureus Membrane filtration method – 6.a procedure
• TCVN 12272: 2018: Phát hiện Staphylococcus aureus /Detection of Staphylococcus aureus
• NAFI6/VS11: 2018 (Ref. AOAC 987.09): Phát hiện Staphylococcus aureus /Detection of Staphylococcus aureus
• AOAC 987.09: Phát hiện Staphylococcus aureus /Detection of Staphylococcus aureus
• NAFI6/VS11: 2018 (Ref. AOAC 987.09): Định lượng Staphylococcus aureus Kỹ thuật MPN /Enumeration of Staphylococcus aureus MPN technique
• AOAC 987.09: Định lượng Staphylococcus aureus Kỹ thuật MPN /Enumeration of Staphylococcus aureus MPN technique
• AOAC 2003.11 TCVN 12656: 2019: Định lượng Staphylococcus aureus Phương pháp đĩa đếm petrifilm /Enumeration of Staphylococcus aureus Petrifilm count plate method
• NAFI6/VS10: 2018 (Ref. AOAC 975.55): Định lượng Staphylococcus aureus Kỹ thuật cấy trãi /Enumeration of Staphylococcus aureus Spread plate technique
• AOAC 975.55: Định lượng Staphylococcus aureus Kỹ thuật cấy trãi /Enumeration of Staphylococcus aureus Spread plate technique

• Baird-Parker Agar (BPA)
• Tryptic Soy Broth (TSB) + 10% NaCl
• Mannitol Salt Agar (MSA)
• Blood Agar

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM STAPHYLOCOCCUS AUREUS

(Theo tiêu chuẩn ISO 6888-1:1999, ISO 22718:2006, USP <62>, AOAC 975.55, TCVN 4830-1:2005)

1. Giới thiệu về Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu, xếp thành chùm nho, có khả năng sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm, nhiễm trùng da và nhiễm khuẩn bệnh viện.

Nguồn lây nhiễm chính:

• Thực phẩm bị nhiễm khuẩn (thịt, sữa, trứng, đồ hộp)
• Mỹ phẩm, dược phẩm, thiết bị y tế
• Môi trường bệnh viện

2. Tiêu chuẩn áp dụng

• ISO 6888-1:1999 & TCVN 4830-1:2005 – Phương pháp đếm S. aureus trong thực phẩm
• ISO 22718:2006 – Kiểm nghiệm S. aureus trong mỹ phẩm
• USP <62> & AOAC 975.55 – Phát hiện S. aureus trong dược phẩm

3. Nguyên tắc phương pháp

Có ba phương pháp chính để kiểm nghiệm S. aureus:

1. Nuôi cấy trên môi trường đặc trưng – Phát hiện sự có mặt của vi khuẩn
2. Định danh bằng sinh hóa và huyết thanh học – Xác nhận S. aureus
3. PCR (Polymerase Chain Reaction) – Xác định nhanh vi khuẩn và gen sinh độc tố

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

• Tủ ấm hiếu khí (37°C ± 1°C)
• Tủ an toàn sinh học cấp II
• Pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy, máy vortex

4.2. Môi trường nuôi cấy

• Baird-Parker Agar (BPA) – Môi trường chọn lọc cho S. aureus
• Tryptic Soy Broth (TSB) + 10% NaCl – Môi trường tăng sinh
• Mannitol Salt Agar (MSA) – Kiểm tra khả năng lên men mannitol
• Blood Agar – Kiểm tra khả năng tan máu

5. Quy trình kiểm nghiệm

5.1. Phát hiện S. aureus bằng nuôi cấy

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

• Mẫu thực phẩm: Cân 25g mẫu, pha loãng với 225mL TSB + 10% NaCl
• Mẫu nước: Lọc 100mL qua màng lọc 0.45 µm
• Mẫu mỹ phẩm, dược phẩm: Hòa tan 10g mẫu vào 90mL TSB

Bước 2: Tăng sinh vi khuẩn

• Ủ TSB ở 37°C trong 24 – 48 giờ

Bước 3: Cấy lên môi trường chọn lọc

• Cấy vạch lên Baird-Parker Agar (BPA), MSA, Blood Agar
• Ủ 37°C trong 24 – 48 giờ

Bước 4: Kiểm tra khuẩn lạc đặc trưng

• Trên Baird-Parker Agar: Khuẩn lạc đen bóng, viền sáng, có vòng halo
• Trên MSA: Lên men mannitol → Khuẩn lạc vàng
• Trên Blood Agar: Tan máu β → Vùng tan máu rõ rệt

📌 Ưu điểm: Tiêu chuẩn quốc tế, độ chính xác cao

5.2. Xác định sinh hóa và huyết thanh học

Bước 1: Kiểm tra sinh hóa

• Catalase test: S. aureus dương tính (bong bóng khí xuất hiện)
• Coagulase test: S. aureus dương tính (huyết tương đông đặc)
• DNase test: Dương tính (vòng sáng trên DNase agar)

Bước 2: Xác định huyết thanh học

• Sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu để xác định loài S. aureus

📌 Ưu điểm: Xác định chính xác loài S. aureus

5.3. Phương pháp PCR phát hiện S. aureus

1. Chiết xuất DNA từ mẫu thực phẩm, nước hoặc mỹ phẩm
2. Khuếch đại gen mecA (kháng methicillin) hoặc gen enterotoxin (độc tố ruột)
3. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
4. So sánh với mẫu đối chứng dương tính và âm tính