• ISO 16649 – Kiểm nghiệm vi khuẩn đường ruột trong thực phẩm
• USP <62> & AOAC 989.14 – Kiểm tra S. pyogenes trong dược phẩm, mỹ phẩm
• CLSI M45 – Hướng dẫn xét nghiệm vi sinh lâm sàng

• Todd-Hewitt Broth (THB)
• Blood Agar (BA, chứa 5% máu cừu)
• Tryptic Soy Broth (TSB)
• CAMP Test Agar

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM STREPTOCOCCUS PYOGENES

(Theo tiêu chuẩn ISO 16649, USP <62>, CLSI M45, AOAC 989.14)

1. Giới thiệu về Streptococcus pyogenes

Streptococcus pyogenes là vi khuẩn Gram dương, hình cầu, xếp chuỗi, thuộc nhóm Lancefield A. Đây là tác nhân gây bệnh viêm họng cấp, sốt thấp khớp, viêm mô tế bào và sốc nhiễm khuẩn.

Nguồn lây nhiễm chính:

• Dịch tiết từ đường hô hấp
• Tiếp xúc trực tiếp với vết thương nhiễm khuẩn
• Thực phẩm, nước uống bị nhiễm khuẩn

2. Tiêu chuẩn áp dụng

• ISO 16649 – Kiểm nghiệm vi khuẩn đường ruột trong thực phẩm
• USP <62> & AOAC 989.14 – Kiểm tra S. pyogenes trong dược phẩm, mỹ phẩm
• CLSI M45 – Hướng dẫn xét nghiệm vi sinh lâm sàng

3. Nguyên tắc phương pháp

Có ba phương pháp chính để kiểm nghiệm S. pyogenes:

1. Nuôi cấy trên môi trường đặc trưng – Phát hiện vi khuẩn
2. Xác định sinh hóa và huyết thanh học – Định danh S. pyogenes
3. PCR (Polymerase Chain Reaction) – Xác nhận nhanh sự có mặt của vi khuẩn

4. Dụng cụ và hóa chất

4.1. Dụng cụ

• Tủ ấm hiếu khí (37°C ± 1°C, có 5% CO₂)
• Tủ an toàn sinh học cấp II
• Pipet vô trùng, đĩa petri, que cấy, máy vortex

4.2. Môi trường nuôi cấy

• Todd-Hewitt Broth (THB) – Môi trường tăng sinh chọn lọc
• Blood Agar (BA, chứa 5% máu cừu) – Phát hiện khả năng tan máu β
• Tryptic Soy Broth (TSB) – Tăng sinh vi khuẩn
• CAMP Test Agar – Kiểm tra yếu tố CAMP

5. Quy trình kiểm nghiệm

5.1. Phát hiện S. pyogenes bằng nuôi cấy

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

• Mẫu bệnh phẩm: Dịch hầu họng, vết thương, máu
• Mẫu thực phẩm, nước: Lọc qua màng lọc 0.45 µm
• Mẫu mỹ phẩm, dược phẩm: Pha loãng với TSB

Bước 2: Tăng sinh vi khuẩn

• Ủ THB hoặc TSB ở 37°C trong 18 – 24 giờ

Bước 3: Cấy lên môi trường chọn lọc

• Cấy vạch trên Blood Agar (5% máu cừu)
• Ủ 37°C trong 24 – 48 giờ (có 5% CO₂)

Bước 4: Kiểm tra khuẩn lạc đặc trưng

• Trên Blood Agar: Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng/xám, có vùng tan máu β (rõ ràng, hoàn toàn)

📌 Ưu điểm: Độ chính xác cao, tiêu chuẩn quốc tế

5.2. Xác định sinh hóa và huyết thanh học

Bước 1: Kiểm tra sinh hóa

• Catalase test: Âm tính (phân biệt với tụ cầu)
• Bacitracin test (0.04U): Nhạy cảm (vòng ức chế ≥10mm)
• PYR test: Dương tính
• Hippurate hydrolysis test: Âm tính (phân biệt với S. agalactiae)

Bước 2: Kiểm tra huyết thanh học

• Sử dụng kháng huyết thanh nhóm A (Lancefield A test)
• Kết tủa dương tính xác nhận S. pyogenes

📌 Ưu điểm: Định danh chính xác loài S. pyogenes

5.3. Phương pháp PCR phát hiện S. pyogenes

1. Chiết xuất DNA từ mẫu bệnh phẩm, thực phẩm hoặc nước
2. Khuếch đại gen speB hoặc emm (đặc hiệu cho S. pyogenes)
3. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
4. So sánh với mẫu đối chứng dương tính và âm tính