Hướng dẫn sử dụng Salmonella Antisera

1. Mục đích sử dụng

Bộ Salmonella Antisera được dùng để định type huyết thanh (serotyping) Salmonella bằng phản ứng ngưng kết kháng nguyên – kháng thể.

Phương pháp này giúp xác định các serotype Salmonella theo hệ thống phân loại Kauffmann-White, dựa trên:

Kháng nguyên thân (O antigen)
Kháng nguyên vỏ (Vi antigen)
Kháng nguyên lông pha 1 (H phase 1)
Kháng nguyên lông pha 2 (H phase 2)

Tài liệu nhấn mạnh rằng việc định type chỉ nên thực hiện sau khi vi khuẩn đã được xác định là Salmonella bằng các xét nghiệm sinh hóa.

2. Các loại kháng huyết thanh trong bộ kit

A. Kháng huyết thanh O (Somatic Antisera)

Đa giá (Polyvalent)

Tên	Chức năng
Omnivalent	Sàng lọc gần như toàn bộ nhóm O của Salmonella
Polyvalent O	Nhóm O thường gặp
Polyvalent O1	Nhóm O bổ sung
Polyvalent A-G	Các nhóm từ A đến G
Polyvalent A-S	Phổ rộng hơn A-G

Dùng để sàng lọc ban đầu.

Đơn giá (Monovalent)

Bao gồm:

O2
O4
O7
O8
O9
O9,46
O3,10
O1,3,19
O11
O13
O6,14
O16
O18
O21
O35

Khi mẫu dương tính với kháng huyết thanh đa giá thì tiếp tục thử các kháng huyết thanh đơn giá tương ứng để xác định nhóm O chính xác hơn.

B. Kháng huyết thanh Vi

Dùng để phát hiện:

Salmonella Typhi
Salmonella Paratyphi C

Kháng nguyên Vi là lớp vỏ bao quanh vi khuẩn và có thể che lấp kháng nguyên O.

Nếu:

Vi (+)
O (-)

thì phải xử lý nhiệt rồi kiểm tra lại để xác định có phải S. Typhi hoặc S. Paratyphi C hay không.

C. Kháng huyết thanh H

Dùng để xác định kháng nguyên lông.

Ví dụ:

Ngoài ra còn có các serum nhóm:

H-G
H-L
H-1
H-z4
H-e,n

và các factor sera tương ứng để xác định chi tiết hơn.

3. Nguyên lý xét nghiệm

Khi trộn:

Kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella
với
Kháng huyết thanh tương ứng

sẽ xảy ra phản ứng:

Kháng nguyên + Kháng thể → Ngưng kết

Nếu xuất hiện ngưng kết nhìn thấy bằng mắt thường thì được xem là phản ứng dương tính.

4. Quy trình xác định nhóm O

Bước 1

Lấy khuẩn lạc Salmonella thuần.

Bước 2

Pha huyền phù vi khuẩn trong nước muối sinh lý.

Bước 3

Nhỏ:

1 giọt huyết thanh đa giá
1 giọt đối chứng nước muối

Bước 4

Trộn trong 1 phút.

Đánh giá

Dương tính

Xuất hiện ngưng kết mạnh trong vòng 1 phút.

Âm tính

Không ngưng kết.
Ngưng kết yếu hoặc xuất hiện muộn.

Bước tiếp theo

Nếu đa giá (+):

→ Thử tiếp các serum đơn giá để xác định nhóm O.

5. Quy trình phát hiện S. Typhi

Nếu:

Polyvalent O (-)
Polyvalent O1 (-)
Vi (+)

thì:

Đun huyền phù vi khuẩn:
- 121°C trong 15 phút
  hoặc
- 100°C trong 1 giờ
Ly tâm.
Thử lại với:
- Vi serum
- O polyvalent serum

Nếu kết quả:

Mẫu sống	Mẫu đun nóng
Vi (+)	Vi (-)
O (-)	O (+)

thì nghi ngờ:

Salmonella Typhi
Salmonella Paratyphi C

Sau đó tiếp tục thử:

để xác định.

6. Xác định kháng nguyên H

Có hai phương pháp:

A. Tube Agglutination (khuyến nghị)

Ưu điểm:

Nhạy hơn
Dễ đọc kết quả

Kết quả dương tính:

Xuất hiện các đám ngưng kết dạng “bông gòn” (cotton wool-like agglutination).

B. Slide Agglutination

Nguyên lý tương tự xét nghiệm O.

Dương tính khi:

Ngưng kết mạnh trong vòng 1 phút.

Nếu dương tính với:

H-L
H-G
H-1
H-z4
H-e,n

thì tiếp tục thử với các factor sera tương ứng để xác định chính xác hơn.

7. Các lưu ý quan trọng

Không dùng môi trường chọn lọc

Nên nuôi cấy trên:

Nutrient Agar

Không nên dùng môi trường chọn lọc vì:

Làm giảm biểu hiện kháng nguyên
Gây tự ngưng kết.

Kiểm tra tự ngưng kết

Trước khi đọc kết quả phải chắc chắn:

Vi khuẩn + nước muối sinh lý

không xuất hiện ngưng kết.

Nếu có:

→ Chọn lại khuẩn lạc khác để thử.

Tăng khả năng di động

Nếu chủng Salmonella di động yếu:

Nuôi cấy qua môi trường bán lỏng (Craigie’s tube)

trước khi định type H.

8. Bảo quản

Nhiệt độ: 2–10°C
Không được đông lạnh.
Đưa thuốc thử về nhiệt độ phòng (15–25°C) khoảng 30 phút trước khi sử dụng.

Kết luận thực hành

Đối với phòng xét nghiệm vi sinh thực phẩm hoặc y tế tại Việt Nam, quy trình thường được thực hiện như sau:

Xác nhận chủng là Salmonella bằng sinh hóa.
Thử Omnivalent hoặc Polyvalent O.
Thử các serum O đơn giá để xác định nhóm O.
Thử Vi serum nếu nghi ngờ S. Typhi.
Thử các serum H để xác định kháng nguyên lông.
Tra bảng Kauffmann-White để xác định serotype cuối cùng (ví dụ: S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Typhi, S. Paratyphi A…).

Đây chính là quy trình chuẩn mà các phòng xét nghiệm tham chiếu, vi sinh thực phẩm và kiểm nghiệm y tế sử dụng để định type Salmonella.