PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH CRONOBACTER SPP. THEO FDA BAM CHAPTER 29 (2023)

PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH CRONOBACTER SPP. THEO FDA BAM CHAPTER 29 (2023)

Cronobacter spp. (trước đây gọi là Enterobacter sakazakii) là vi khuẩn Gram âm, thuộc họ Enterobacteriaceae, có thể gây viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết và viêm ruột hoại tử, đặc biệt ở trẻ sơ sinh và trẻ sinh non.
Các vụ nhiễm khuẩn nghiêm trọng đã được ghi nhận liên quan đến sữa bột trẻ em (powdered infant formula).

Hiện nay, cơ quan FDA Hoa Kỳ quy định phương pháp kiểm nghiệm chính thức trong Bacteriological Analytical Manual (BAM) – Chapter 29: Cronobacter (Cập nhật tháng 11/2023).

⚗️ Nguyên lý phát hiện

Phương pháp BAM 29 kết hợp hai kỹ thuật song song:

Kỹ thuật	Mục đích	Ghi chú
qPCR (Real-time PCR)	Phát hiện nhanh DNA đặc hiệu của Cronobacter spp.	Kết quả dương tính cần xác nhận bằng nuôi cấy
Phương pháp nuôi cấy (Cultural method)	Phân lập, quan sát hình thái khuẩn lạc và định danh vi sinh vật	Là phương pháp “chuẩn vàng” xác nhận

🧫  Quy trình phát hiện – Tổng quan

Bước 1. Chuẩn bị mẫu và tăng sinh không chọn lọc

• Mẫu: sữa bột trẻ em hoặc nguyên liệu.
• Hòa 100 g mẫu với 900 mL Buffered Peptone Water (BPW).
• Ủ ở 36 ± 2°C trong 24 ± 2 giờ.

Bước 2. Xét nghiệm qPCR (sàng lọc nhanh)

• Ly tâm dịch tăng sinh, lấy phần cặn.
• Tách DNA bằng dung dịch PrepMan™ Ultra.
• Chạy qPCR trên thiết bị ABI 7500 Fast với cặp mồi đặc hiệu vùng gen rpsU–dnaG.
• Có Internal Amplification Control (IAC) để đảm bảo không bị ức chế phản ứng.
• Nếu dương tính → chuyển sang bước nuôi cấy xác nhận.

Bước 3. Phân lập trên môi trường chọn lọc

• Dùng 1 vòng cấy hoặc 100 µL dịch tăng sinh để cấy trên các môi trường:

Môi trường	Nhiệt độ ủ	Màu khuẩn lạc điển hình
Brilliance Enterobacter sakazakii Agar (DFI)	36 ± 1°C	Xanh lục, vàng lục
R&F Cronobacter Agar	36 ± 1°C	Xanh lam – đen trên nền đỏ
Chromogenic Cronobacter Isolation Agar (CCI)	41.5 ± 1°C	Xanh lục nhạt – vàng lục
Enterobacter sakazakii Isolation Agar (ESIA)	44 ± 1°C	Xanh lam – xanh lục đậm

• Quan sát sau 24 ± 2 h; nếu cần, có thể kéo dài đến 48 h để màu sắc rõ hơn.

Bước 4. Nhận diện khuẩn lạc nghi ngờ

Môi trường	Hình ảnh/màu sắc	Ghi chú
DFI	Xanh lục – vàng lục, tròn, bóng	Đặc trưng α-glucosidase (+)
R&F	Xanh lam – đen	Nền đỏ hoặc tím
CCI	Xanh lục nhạt – vàng lục	Tăng độ chọn lọc ở 41.5°C
ESIA	Xanh lam – xanh lục	Một số chủng có màu xanh nhạt

---

🧬 5. Xác nhận và định danh

PCR xác nhận

• Lấy khuẩn lạc nghi ngờ, hòa vào nước PCR, đun sôi 5 phút, ly tâm, dùng dịch nổi làm DNA mẫu.
• Chạy qPCR lại để xác nhận gene đặc hiệu Cronobacter spp.

Định danh sinh hoá

• Dùng VITEK® 2 Compact – GN ID Card để định danh tự động.
• Nếu qPCR và VITEK 2 đều cho kết quả dương tính → khẳng định Cronobacter spp.

Định lượng (tùy chọn)

• Thực hiện bằng phương pháp MPN – Most Probable Number để ước tính số lượng vi khuẩn/g mẫu.